Resumo: Cana de açúcar é uma das plantas mais eficientes em coletar e converter a luz solar em energia química, apresentando alta capacidade de acumular biomassa. Recentemente, com o advento do desenvolvimento do etanol de segunda geração (E2G), ou etanol lignocelulósico, o bagaço tem recebido atenção como matéria prima para a produção desse biocombustível. O seu uso, porém, apresenta grandes desafios, principalmente porque a biomassa de cana é lignificada (~23%), situação que limita o processo de sacarificação. Portanto, o estudo dos fatores que governam a recalcitrância da parede celular em plantas que apresentam características de bioenergia é de relevante importância para o desenvolvimento de variedades híbridas de cana em programas de bioenergia, de tal forma que a produção de E2G possa ser maximizada. O objetivo desta pesquisa foi estudar a biossíntese de lignina em Saccharum spontaneum, Saccharum officinarum, Saccharum robustum e Saccharum barberi, através da identificação de genes da via biossintética da lignina e da análise dos componentes da parede celular em internódios novos (segundo + terceiro) e maduros (oitavo). Neste estudo, o conteúdo de carboidratos estruturais e não estruturais foi contrastante entre as espécies, uma vez que S. officinarum e S. barberi tiveram maior de acúmulo de açúcares solúveis totais, enquanto S. spontaneum e S. robustum apresentaram maior deposição de polissacarídeos estruturais. S. spontaneum apresentou um acúmulo notável de amido com relação às outras espécies de Saccharum. S. spontaneum e S. robustum apresentaram o maior conteúdo de glicose, enquanto xilose foi maior em S. officinarum e S. barberi. A determinação do conteúdo de lignina, em adição a testes histoquímicos com corantes específicos para lignina, confirmaram a maior deposição deste polímero nos internódios maduros das quatro espécies estudadas, sendo o processo de lignificação mais acentuado em S. spontaneum e S. robustum. A razão S/G e a porcentagem de sacarificação em internódios maduros foram menores em S. spontaneum e S. robustum do que em S. officinarum e S. barberi, e não apresentaram correlação, ou seja, a maior presença de unidades S não se refletiu em maior taxa de sacarificação. A análise do perfil de oligômeros por UPLC/MS foi possível identificar 11 estruturas, entre aldeídos, monômeros, dímeros e trímeros. Independentemente da idade do internódio, S. spontaneum e S. robustum possuem a maior diversidade e frequência de oligômeros quando comparadas com S. officinarum e S. barberi. A análise por espectroscopia 2D HSQC NMR evidenciou que S. barberi e S. officinarum possuem maior porcentagem de p-hidroxicinamatos (p-coumarato e ferulato) e grupos acetil substituintes (posição C-3 e total). Um total de 13 unigenes foram identificados nas espécies de Saccharum, os quais foram: 1 COMT, 1 HCT, 1 F5H, 2 4CLs, 3 CAD,1 C3H, 1 C4H, 2 CCoAOMT e 1 CCR. A análise das árvores filogenéticas revelam que as sequências das enzimas da rota biosintética da lignina das espécies de Saccharum se agruparam preferencialmente, com o seus ortologos de Sorghum bicolor e Zea mays e cana de açúcar (parentes mais próximos do gênero Saccharum na tribo Andropogoneae) em clados sempre suportados por alto valores de bootstrap. Os genes identificados apresentaram alta homologia entre si e com híbridos comerciais (Bottcher et al., 2013). Desta forma, os resultados mostram que existe conservação entre os genes entre espécies e híbridos, mas que de alguma forma sua regulação influência o conteúdo e o tipo de lignina. Não foram feitas análises de expressão neste estudo, mas independente disso, os resultados mostram a importância de se estudar os fatores de transcrição no controle da biossíntese e de lignina, o que poderia explicar as variações encontradas no conteúdo e composição desse polímero da parede celular Ver menos

Abstract: Sugarcane ranks among the most efficient plants when it comes to collecting and converting sunlight into chemical energy, displaying a high capacity to accumulate biomass. With the advent of second generation ethanol (2GE), otherwise known as lignocellulosic ethanol, the bagasse has received a lot of attention as raw material for the production of said biofuel. Its use, however, poses great challenges, especially because the cane¿s biomass is lignified (~23%), which limits the saccharification process. Therefore, the study of the factors that govern the cell wall¿s recalcitrance in plants that present characteristics of bioenergy is relevant to the development of hybrid kinds of cane in bioenergetics programs in order to maximize the production of 2GE. The objective of this research has been to study biosynthesis of lignin in the Saccharum spontaneum. Saccharum officinarum, Saccharum robustum and Saccharum barberi species through the identification of genes of the biosynthetic pathway of lignin and the analysis of the components of the cell wall in bot new (second + third) and mature (eighth) internodes. In this study, the content of both structural and non-structural carbohydrates has been contrasting between the different species, since both S. officinarum and S. barberi had a larger accumulation of total soluble sugars, while S. spontaneum and S. rubustum had a larger deposition of structural polysaccharides. S. spontaneum presented a noticeable accumulation of starch in comparison with other species of Saccharum. S. spontaneum and S. robustum presented the largest glucose content, while the xylose was more abundant in S. officinarum and S. barberi. The determination of the lignin content, in addition to histochemical tests with lignin-specific dyes, has confirmed the larger deposition of this polymer in the mature internodes of the four studied species, the lignification process being more accentuated in S. officinarum e S. barberi. The S/G ratio and the saccharification percentage in mature internodes were smaller in S. spontaneum and S. robustum than in S. officinarum and S. barberi, and presented no correlation, that is, the bigger presence of S units did not translate into a higher saccharification ratio. From the analysis of the profile of the oligomers by UPLC/MS it was possible to identify 11 structures between aldehydes, monomers and trimers. Independently from the internodes¿ age, S. spontaneum and S. robustum possess the largest variety and frequency of oligomers when compared to S. officinarum and S. barberi. The analysis through 2D HSQC NMR spectroscopy has brought evidence that S. officinarum and S. barberi possess a larger percentage of p-hydroxycinnamates (p-coumarate and ferulate) and acetyl substituent groups (C-3 position and total). 13 unigenes in total have been identified in the Saccharum species, which were: 1 COMT, 1 HCT, 1 F5H, 2 4CLs, 3 CAD, 1 C3H, 1 C4H, 2 CCoAOMT and 1 CCR. The analysis of the phylogenetic trees revealed that the sequences of enzymes from the Saccharum species¿ lignin¿s biosynthetic pathway grouped preferentially with its orthologs of Sorghum bicolor, Zea mays and sugarcane (the most closely related to the Saccharum gender in the Andropogoneae tribe) into clades always supported by high bootstrap values. The identified genes presented high homology between themselves and with commercial hybrids (Bottcher et al., 2013). Thus, the results show that there is conservation of genes between species and hybrids, but their regulation influences somehow both the content and the kind of lignin. Expression analysis weren¿t made in this study, but the results show nevertheless the importance of studying the transcription factors in the control of lignin biosynthesis, which could explain the variations found in both content and composition of this polymer in the cell wall Ver menos