Resumo: Estratégias clínicas devem voltar-se para a máxima desagregação/redução da carga microbiana, assim como para eliminação e/ou inativação de lipopolissacarídeos (LPS) e demais produtos tóxicos e assim, reduzir o potencial inflamatório do conteúdo endodôntico aos tecidos periapicais. Os objetivos do presente estudo foram: 1) Avaliar a efetividade do sistema Reciproc (R25) em comparação com diferentes sistemas rotatórios na remoção de bactérias e endotoxinas de canais radiculares contaminados (artigo 1); Investigar a influência da interação entre substâncias antimicrobianas utilizadas na terapia endodôntica e o substrato Limulus Amebocyte Lysate (LAL) para quantificação de endotoxinas, com o objetivo de identificar substâncias interferentes quando da leitura dos níveis de endotoxinas em amostras clínicas (artigo 2); Monitorar "in vivo" a efetividade do preparo químico-mecânico (PQM) com NaOCl 2,5% e Clorexidina (CHX) gel 2% (tendo como controle o soro fisiológico [SS]) após o uso do EDTA 17% e medicação intracanal na redução de LPS, elucidando a contribuição de cada etapa da terapia endodôntica na redução de endotoxinas (artigo 3); Estudar o perfil da microbiota e níveis de endotoxinas nas infecções endodônticas primárias com lesão periapical, determinando o potencial inflamatório do conteúdo endodôntico contra macrófagos através da produção de IL1- ß e TNF-?. Além disso, comparar "in vivo" a efetividade do preparo químico-mecânico (PQM) com NaOCl 2,5% e Clorexidina (CHX) gel 2% e após o uso do EDTA 17% e medicação intracanal na eliminação de LPS, tendo como controle, soro fisiológico (SS) (artigo 4); Investigar a influência de diferentes substâncias químicas auxiliares utilizadas no tratamento endodôntico e da medicação à base de hidróxido de cálcio por diferentes períodos na estrutura e bioatividade do lipopolissacarídeo bacteriano, visando elucidar a ocorrência de possíveis implicações na detecção do lipideo A/ LPS e posteriormente, seu potencial imunoestimulador em receptores TLR-4 (artigo 5). Métodos: Amostras foram coletadas de canais radiculares utilizando cones de papel estéreis/despirogenizados. PCR (16s rDNA), contagem de unidades formadoras de colônias e método LAL foram utilizados. Macrófagos Raw 264.7 foram estimulados com conteúdo endodôntico infeccioso e determinação dos níveis de IL1- ß e TNF-? foi realizada por meio de ELISA. Espectrometria de massa (MALDI-TOF) e silver staining determinaram a presença de picos de lipídeo A e bandas correspondentes à presença de LPS após tratamentos, respectivamente. Em paralelo, ativação de TLR-4 foi realizada para determinação do potencial imunoestimulador do LPS. Resultados: Artigo 1- Não houve diferença entre o sistema Reciproc R25 e os diferentes sistemas rotatórios na remoção de bactérias e endotoxinas de canais radiculares contaminados, respectivamente: Reciproc (99.34% e 91.69%); GII - Mtwo (99.86% e 83.11%); GIII- ProTaper (99.93% e 78.56%); and GIV- FKG RaceTM (99.99% e 82.52%). Artigo 2- Água oxigenada 30%, Otosporin® e pasta tripla antibiótica causaram inibição/superestimação dos níveis de endotoxina em todas as diluições testadas. Artigo 3- PQM foi capaz de reduzir significativamente os níveis de LPS: NaOCl 2.5% (99.65%) (GI), CHX 2% (94.27%) (GII), e SS (96.79%) (GIII) (p<.05). Medicação intracanal por 30 dias contribuiu para potencializar a redução de endotoxinas: NaOCl 2.5% (90%) (GI), CHX 2% (88.8%) (GII) e SS (85.7%) (GIII, p<.05). Artigo 4- Porphyromonas gingivalis (17/30), Porphyromonas endodontalis (15/30) e Prevotella nigrescens (11/30) foram as espécies bacterianas mais prevalentes em infecções endodônticas primárias. Endotoxinas foram detectadas em 100% dos canais radiculares. O PQM foi capaz de reduzir significativamente os níveis de LPS (p<0.05). NaOCl 2,5% associado à instrumentação rotatória Mtwo® obteve menores níveis de LPS residuais (NaOCl 2,5%= 0,09 EU/mL; CHX 2%= 0,81 EU/mL; SS= 4,81 EU/mL). Após uso do EDTA 17% e do hidróxido de cálcio não foram encontradas diferenças estatísticas entre NaOCl 2,5% e CHX gel 2%. IL-1? and TNF-? foram produzidos por macrófagos estimulados com conteúdo endodôntico inicial, decrescendo seus níveis proporcionalmente após a incorporação do procedimento intracanal subsequente (p<0.05). Artigo 5- NaOCl 5,25% e Ca(OH)2 após 24h induziram a perda de detecção de lipideo A e de LPS, enquanto que nenhuma alteração estrutural foi observada após espectrometria de massa do lipídeo A e silver staining do LPS tratado com as demais substâncias químicas auxiliares. Quanto à ativação de TLR-4, LPSs tratados por NaOCl 5,25% e Ca(OH)2 foram significativamente menos potentes em ativar TLR-4 quando comparado com as demais substâncias testadas. Foi possível concluir que: (R25) foi tão efetivo quanto os sistemas rotatórios de múltiplas limas na remoção de bactérias e endotoxinas de canais radiculares contaminados (artigo 1); Características de desempenho - precisão e reprodutibilidade- do teste cinético turbidimétrico para quantificação de endotoxinas são influenciadas pela interação do substrato LAL com água oxigenada 30%, Otosporin® e pasta tripla antibiótica (artigo 2); Elevada redução de endotoxinas ocorre após o preparo químico-mecânico e após uso da medicação intracanal (artigo 3). Procedimentos adicionais após o PQM potencializam a redução de endotoxinas. Consequentemente, há progressiva redução do potencial inflamatório do conteúdo endodôntico quanto à produção de IL1- ? e TNF-? (artigo 4); NaOCl 5,25% e pasta de hidróxido de cálcio são capazes de induzir perda de detecção do lipideo A/LPS, comprometendo sua integridade estrutural e, portanto, neutralizando seu potencial imunoestimulador em receptores TLR-4 (artigo 5) Ver menos

Abstract: Clinical strategies must be performed in order to achieve major reduction of the microbial load, as well as the elimination and/or inactivation of lipopolysaccharides (LPS) and other toxic products and, therefore, reducing the inflammatory potential of endodontic content to periapical tissues. The objectives of this study were: 1); To assess the effectiveness of Reciproc (R25) system compared to different rotary systems in removing bacteria and endotoxin from contaminated root canals (Article 1); To investigate the influence of the interaction of antimicrobial substances used in endodontic therapy and Limulus amebocyte lysate (LAL) substrate in order to identify interfering substances for endotoxin measurement in clinical samples (Article 2); To monitor the effectiveness of the chemol-mechanical preparation (CMP) by testing 2.5% NaOCl and 2% Chlorhexidine (CHX) gel 2% (using saline [SS] as a control,) after the use of 17% EDTA and calcium hydroxide paste, elucidating the contribution of each step of the endodontic therapy in the reduction of endotoxins (article 3);To determine target bacterial species and endotoxin levels in primary endodontic infections and the inflammatory potential of endodontic content against macrophages through IL1- ß e TNF-? production. Elimination of LPS was assessed by the chemo-mechanical preparation (CMP) with 2.5% NaOCl or 2% Chlorhexidine (CHX) gel and after the use of 17% EDTA and intracanal dressing, using saline solution (SS) as a control (Article 4); To investigate the influence of auxiliary chemical substances of endodontic therapy and calcium hydroxide dressings on the structure and bioactivity of bacterial lipopolysaccharide, and thus to elucidate the occurrence of Lipid A/LPS structural alterations and their further functional response in TLR-4 (Article 5)-. Methods: Samples were collected from root canals using sterile/ apirogenic paper points. PCR (16S rDNA), counting of colony forming units and LAL method were performed. IL1- ß e TNF-? produced by macrophages were measured by ELISA. Structural analysis of the lipid A/LPS was conducted by means of MALDI-TOF mass spectrometry and silver staining, respectively. TLR-4 activation was performed to determine the immunostimulatory potential of LPS after different treatments. Results: Article 1- No statistical differences were found between the Reciproc R25 and the different rotary systems for bacterial and endotoxin removal, respectively: Reciproc (99.34% and 91.69%); GII - Mtwo (99.86% and 83.11%); GIII- ProTaper (99.93% and 78.56%); and GIV- FKG RaceTM (99.99% and 82.52%) (p> 0.01). Article 2- Hydrogen peroxide 30%, Otosporin® and triple antibiotic paste caused inhibition/ enhancement of endotoxin levels in all dilutions. Article 3- Irrespective of the irrigant, CMP was able to significantly reduce LPS levels: NaOCl 2.5% (99.65%) (GI), CHX 2% (94.27%) (GII), and SS (96.79%) (GIII) (p <.05). Calcium hydroxide paste for 30 days contributed to enhance endotoxin reduction: NaOCl 2.5% (90%) (GI), CHX 2% (88.8%) (GII) and SS (85.7%) (GIII, p <.05). Article 4- Porphyromonas gingivalis (17/30), Porphyromonas endodontalis (15/30) and Prevotella nigrescens (11/30) were the most prevalent bacterial species in primary endodontic infections. Endotoxins were present in 100% of root canals. CMP drastically reduced endotoxins (p<.05). 2.5% NaOCl associated to rotary instrumentation obtained the highest reduction (NaOCl 2,5%= 0,09 EU/mL; CHX 2%= 0,81 EU/mL; SS= 4,81 EU/mL). After rinse with 17% EDTA and intracanal dressing no statistical differences were found between groups (p >.05). IL-1? and TNF-? were produced by macrophages stimulated with initial endodontic content. A proportional decrease of cytokine levels was found after each root canal procedure (p <0.05). Article 5- 5.25% NaOCl and Ca(OH)2 induced both loss of peak of lipid A and LPS detection, while no structural alteration was observed after LPS treatment with other auxiliary chemical substances. In parallel, LPSs treated with 5.25% NaOCl and Ca(OH)2 were significantly less potent in activating TLR4 when compared to other substances (p <0.0001). It was concluded that: Reciproc (R25) was as effective as the rotary multifile systems for bacteria and endotoxin removal from contaminated root canals (Article 1); The performance characteristics - accuracy and reproducibility- of the turbidimetric kinetic assay for quantification of endotoxins are influenced by the interaction of LAL substrate with Hydrogen peroxide 30%, Otosporin® and triple antibiotic paste (Article 2); High endotoxin reduction occurs after chemical-mechanical preparation and after the use of calcium hydroxide paste (Article 3). Additional endodontic procedures enhance endotoxin reduction (Article 3). Consequently, it was found a progressively lower activation of macrophages for IL-1? and TNF-? production (Article 4); 5.25% NaOCl and calcium hydroxide paste were capable of inducing loss of lipid A peaks and LPS detection, rendering a lower immunostimulatory potential against TLR-4 (Article 5)
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