Resumo: Xanthomonas citri subsp. citri (Xac) é uma bactéria Gram-negativa responsável pela doença do cancro cítrico em uma grande variedade de plantas cítricas, causando grandes perdas econômicas. Xac sobrevive como epífita nas superfícies foliares e causa a doença após a penetração e crescimento dentro do parênquima mesofílico de plantas suscetíveis. Como uma bactéria associada a plantas, Xac precisa se adaptar às condições ambientais em constante mudança. Fatores sigma alternativos da família extracitoplásmica (ECF) estão envolvidos na regulação da expressão gênica em resposta ao estresse ambiental. O genoma de Xac306 codifica 9 fatores sigmas ECF, o que provavelmente reflete seu estilo de vida e sugere um papel importante desta família de reguladores transcricionais na adaptação de Xac. O objetivo deste estudo é caracterizar a função de um fator sigma ECF encontrado no genoma de Xac, denominado sigF. Para isso, foram obtidas duas linhagens com níveis alterados de sigF: uma linhagem mutante (?sigF) por deleção em fase do gene e uma linhagem com cópia extra do gene em vetor multicópia, o que promove a super-expressão deste sigma. Ensaios de virulência em hospedeiro suscetível demonstraram que sigF não é necessário para a virulência em Xac. A sensibilidade da linhagem ?sigF a diferentes tipos de estresse ambiental também foi analisada, incluindo estresse oxidativo, por radiação UV, deficiência de ferro e tratamento com o agente quelante de metais ácido fítico, não sendo observadas diferenças na viabilidade quando comparada com a linhagem selvagem. Além disso, as linhagens com níveis alterados de sigF não apresentaram alterações na capacidade de formar biofilmes e aderir às folhas da planta. Curiosamente, observamos que SigF é essencial para a sobrevivência de Xac a predação pela ameba de vida livre Dictyostelium discoideum. Resultados de ensaios de RT-PCR quantitativo e RNA-Seq demonstram que a super-expressão de uma versão que mimetiza um estado fosforilado de SigF causa indução da expressão de genes que codificam componentes de um sistema de secreção do tipo VI (SSVI) de Xac,que também tem papel essencial na sobrevivência a D.discoideum. Ensaios preliminares de fosforilação in vitro pela incubação de SigF purificada com a proteína quinase PknB, codificada por um gene localizado em provável operon com sigF, reforçam o modelo proposto, no qual SigF é regulado em nível pós-traducional por fosforilação. Além disto, nossos resultados demonstram que SigF regula positivamente a expressão do SSVI de Xac Ver menos

Abstract: Xanthomonas citri subsp. citri (Xac) is a Gram-negative bacterium responsible for citrus canker disease in a wide variety of citrus plants, causing major economic losses. Xac survives as epiphyte on leaf surfaces and causes the disease after penetration and growth inside mesophyll parenchyma of susceptible plants. As a plant-associated bacterium, Xac needs to adapt to constantly changing environmental conditions. Alternative sigma factors of the extracytoplasmic family (ECF) are involved in the regulation of gene expression in response to environmental stress. The genome of Xac strain 306 encodes 9 sigma factors of the ECF family, which probably reflects its lifestyle and suggests an important role of this family of transcriptional regulators in Xac adaptation. The aim of this study is to characterize the function of one ECF sigma factor found in Xac genome, named sigF. For that, we have constructed a sigF mutant strain (?sigF) by in frame deletion of the gene and an overexpression strain, which contains an extra copy of sigF in a multicopy plasmid. Results from virulence assays in a susceptible host have shown that sigF is not required for Xac virulence. We've also tested sensitivity of the ?sigF strain to distinct types of environmental stress, including oxidative stress, UV radiation, iron deprivation and treatment with the metal chelating agent phytic acid and no difference in viability was observed when compared to the wild type strain, indicating the SigF is not required under these conditions. In addition, we have not observed differences in biofilm formation and adhesion to plant leaves caused by deletion or overexpression of sigF. Interestingly, our results show that SigF is required for Xac survival to predation by the amoeba Dictiostelium discoideum. In addition, results from qRT-PCR analysis and RNA-seq experiments have shown that overexpression of a SigF phospho-mimicking mutant version promotes induction of genes from a Xac type VI secretion system required for survival to D. discoideum. Prelimary in vitro phosphorylation assays using purified SigF and PknB Ser/thr kinase encoded in the same operon as sigF corroborates with a model in which SigF is post-translational regulated by phosphorylation. Our results also suggest that SigF positively regulates Xac SSVI Ver menos