Resumo: As proteínas da linhaça, assim como outras proteínas de origem vegetal, estão naturalmente associadas aos compostos fenólicos. Durante a hidrólise enzimática dessas proteínas, peptídeos e compostos fenólicos são liberados e podem exercer atividades antioxidante e anti-inflamatória. Este estudo avaliou a influência do complexo proteína-fenólico e da hidrólise com Alcalase e/ou enzimas digestivas sobre a capacidade antioxidante (CA) de produtos de linhaça. Investigou-se também a capacidade anti-inflamatória dos hidrolisados proteicos e compostos fenólicos da linhaça in vitro, pela inibição da produção de mediadores inflamatórios em macrófagos estimuladas por IFN-?/LPS e, in vivo, por meio da modulação da inflamação em animais com retocolite ulcerativa induzida por TNBS. O isolado proteico de linhaça (FPI) foi obtido a partir da farinha de linhaça desengordurada por extração alcalina (pH 9,0) e precipitação no ponto isoelétrico (pH 4,2) seguida de neutralização (pH 6,0). O hidrolisado de proteína de linhaça (FPH) foi produzido a partir da hidrólise do FPI com Alcalase. Para obter o isolado e hidrolisado proteico de linhaça com reduzido teor fenólico (phr-FPI e phr-FPH, respectivamente) a farinha de linhaça desengordurada foi lavada com etanol antes do processo de isolamento, para remoção da fração fenólica (Phi). A fração fenólica hidrolisada (Phh) foi obtida submetendo-se a Phi às mesmas condições de pH e temperatura utilizadas na hidrólise dos isolados proteicos. A análise de fluorescência intrínseca foi utilizada para avaliar a formação do complexo proteína: fenólico e a CA foi determinada pelos métodos ORAC e FRAP. As amostras Phi e Phh apresentam a maior CA seguida dos hidrolisados e isolados proteicos. A presença de compostos fenólicos nas amostras proteicas foi responsável pelo aumento de até 80% na CA do isolado proteico, medida pelos métodos ORAC e FRAP, enquanto que para o hidrolisado proteico ela foi responsável por um aumento de 15% da CA medida por ORAC, e 80%, quando medida por FRAP. Após a simulação da digestão, a CA dos isolados e hidrolisados proteicos aumentou e a influência dos compostos fenólicos na capacidade antioxidante persistiu, especialmente quando determinada por FRAP. Nossos resultados sugerem que CA de isolados deve-se principalmente à formação do complexo proteína:fenólico, enquanto que nos hidrolisados a CA deve-se possivelmente ao sinergismo entre fenólicos e peptídeos liberados a partir da hidrólise com Alcalase ou com as enzimas digestivas. Além disso, a transferência de H+ parece ser o principal mecanismo pelo qual as proteínas de linhaça atuam como antioxidantes. Em relação à capacidade antioxidante do phr-FPH, foram identificados quatro sequências de peptídeos usando LC-MS/MS e uma sequência foi identificada por degradação de Edman (GFPGRLDHWCASE) a qual apresentou CA maior do que a do antioxidante sintético BHA. Em relação ao efeito anti-inflamatório, as amostras Phi, Phh, FPH e phr-FPH foram capazes de inibir a produção de NO e TNF-? em macrófagos estimulados com IFN-?/LPS. No estudo in vivo, Phi e phr-FPH foram capazes de atenuar a perda de peso dos animais, as respostas inflamatórias das células TH1 e TH17, a proliferação de linfócitos TCD4+ e os níveis de citocinas inflamatórias em animais com retocolite induzida por TNBS. De forma geral os resultados demonstram que os hidrolisados proteicos e os compostos fenólicos da linhaça possuem atividade antioxidante e anti-inflamatória. Mais estudos são necessários para avaliar a interferência do complexo proteína:fenólico na biodisponibilidade de peptídeos e fenólicos, e a relação destes compostos com a microbiota intestinal para conhecer a real capacidade destes produtos em fornecer benefícios ao organismo Ver menos

Abstract: Flaxseed protein is a potential source of bioactive compounds. During the enzymatic hydrolysis of vegetable proteins, peptides and phenolic compounds, which are associated with proteins, are released and may act as antioxidants and anti-inflammatory. This study evaluated the influence of the hydrolysis with Alcalase and simulated gastrointestinal digestion on the antioxidant capacity of different flaxseed products. We also evaluated the inhibitory capacity of flaxseed protein hydrolysates and phenolic fractions on the production of inflammatory mediators by stimulated macrophages and the anti-inflammatory effects on TNBS-induced colitis. The Flaxseed protein hydrolysate (FPH) was produced with protein isolate obtained from defatted meal by alkaline extraction (pH 9.0) followed by precipitation (pH 4.2) and neutralization (pH 6.0). In order to obtain phenolic reduced flaxseed protein hydrolysate (phr-FPH), flaxseed was extracted from defatted meal with ethanol before isolating process. The hydrolysis was performed with Alcalase (pH 8.5; enzyme/substrate 1/90, w/w). Hydrolysed phenolics compounds (Phi) was obtained with the phenolics compounds extracted from the defatted flaxseed meal using the same conditions of protein hydrolysis. Four glycosylated phenolic compounds ¿ secoisolariciresinol and ferulic, p-coumaric, caffeic acids ¿ were identified using HPLC-MS/MS. Intrinsic fluorescence was used to analyze protein:polyphenol complex. A chromatographic characterization of the samples was performed and the AC was determined by FRAP and ORAC methods. A chromatographic separation of the phr-FPH by RP-HPLC was performed, and the AC of the six obtained fractions was determined. Flaxseed phenolic fractions exhibit the highest antioxidant capacity followed by flaxseed protein hydrolysates and isolates. The presence of phenolic compounds increased 80% of antioxidant capacity of the protein isolate, measured by ORAC and FRAP methods, while for the hydrolysates accounted for 15% measured by ORAC, and 80% when measured by FRAP. After simulated digestion, the antioxidant capacity of isolates and hydrolysates increased and the influence of phenolics on their antioxidant capacity persisted, especially when determined by FRAP. Our findings suggest that AC of isolates is mainly due to the protein: phenolic complex while in the hydrolysates is mainly by the synergism between phenolics and peptides released by Alcalase or simulated digestion. Also, the preferential mechanism that flaxseed protein may act as antioxidant is the H+ atom transfer. Four peptide sequences could be identified by using LC-MS/MS and one by Edman degradation. The peptide sequence GFPGRLDHWCASE was synthesized and showed a value higher than that of butylated hydroxyanisole. The identified sequences represent an advance in the molecular characterization of the flaxseed protein fraction. Regarding to the anti-inflammatory effect of flaxseed extracts, Phi, Phh, FPH and phr-FPH inhibit NO and TNF-? secretion in stimulated RAW cells and also downregulating weight loss, histological inflammation, TH1 and TH17 responses, T cell proliferation and inflammatory cytokine levels on TNBS-induced colitis in BALB/c mice. Together, the results demonstrate that flaxseed protein hydrolysates and phenolic isolated fractions had antioxidant activity and protective effects on a TNBS-induced colitis model. More studies are needed to evaluate the effect of the protein complex: phenol in the bioavailability of peptides and phenolics, and the relationship of these compounds with the intestinal microbiota to know the real ability of these products to provide health benefits Ver menos