Orientadores: Gonçalo Amarante Guimarães Pereira, Juan Lucas Argueso

Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia

Resumo: A floculação é um processo de agregação celular observado em muitas linhagens de Saccharomyces cerevisiae que resulta em sedimentação, prejudicando o rendimento fermentativo e a operação de destilarias produtoras de bioetanol. A maioria das linhagens utilizadas por essa indústria, incluindo...

Resumo: A floculação é um processo de agregação celular observado em muitas linhagens de Saccharomyces cerevisiae que resulta em sedimentação, prejudicando o rendimento fermentativo e a operação de destilarias produtoras de bioetanol. A maioria das linhagens utilizadas por essa indústria, incluindo a linhagem PE-2/JAY270, foi selecionada pela incapacidade de flocular. O controle genético da floculação é bem caracterizado, vários genes foram associados ao fenômeno, incluindo principalmente a família de genes FLO. Previamente observamos que a linhagem JAY291 (haploide derivado de JAY270) não flocula, apesar de possuir o alelo funcional do regulador positivo de floculação FLO8, sugerindo que seu fenótipo envolve outro passo dessa via. A análise da progênie F2 do cruzamento de JAY291 com a linhagem de laboratório S288 (flo8-1) revelou uma proporção fenotípica de ~1:8 (floculantes/não floculantes), esperada para uma característica controlada por três genes não ligados. Sequenciamos os genomas de oito indivíduos F2 floculantes segregando ~40.000 SNPs existentes entre S288c e JAY291. As sequências foram comparadas entre si para localizarmos regiões que co-segregavam com a floculação. Esse mapeamento preliminar foi refinado por PCR-RFLP, revelando um segundo gene, FLO1, que está ausente em JAY291. Para identificar o terceiro gene, analisamos fenotipicamente novos haploides F2 segregantes de um cruzamento entre S288c (FLO8::KanMX4 FLO1::HphMX4) e JAY291 (FLO8 flo1?), dentre os quais os indivíduos FLO1:HphMX4 foram divididos em dois "bulks" (floculante e não floculante) e sequenciados. As frequências alélicas S288c ou JAY291 nos "bulks" foram interrogadas e validadas estatisticamente, revelando um terceiro gene fortemente associado ao fenótipo: MSS11 (fator de transcrição envolvido em floculação). Encontramos ainda outros doze loci contendo genes de efeito menor, mas que atuam como modificadores do fenótipo. Em experimentos independentes, observamos alteração na morfologia de colônia de JAY270 e troca de seu típico fenótipo liso para rugoso, também associado com um grau baixo de floculação. Tais colônias rugosas também são frequentemente encontradas na indústria. Curiosamente, o mesmo fenótipo foi observado cruzando-se haploides específicos derivados de JAY270. Os cruzamentos sugeriram que o fenótipo era controlado um único gene, porém específico de diploides. O mapeamento em genomas de haploides de JAY270 revelou o gene responsável pela alteração de fenótipo: ACE2, envolvido com separação celular. JAY270 é heterozigota para uma mutação frameshift em ACE2 (ACE2/ace2-7A). O fenótipo rugoso ocorre por recombinação mitótica associada com viii perda de heterozigosidade (LOH), produzindo células com duas cópias mutadas desse gene. Para evitar futuros problemas industriais causados pela sedimentação de linhagens rugosas resultantes de LOH na região de ACE2, o defeito detectado ace2-7A foi reparado no genoma da JAY270. O diploide FGY050 (ura3?/ura3?), derivado de JAY270 e auxotrófico para uracila, foi utilizado como plataforma. A linhagem desenvolvida passou a ter duas cópias do alelo selvagem de ACE2 (ACE2/ACE2) e portanto é incapaz de se tornar rugosa por recombinação. Finalmente, em um estudo não relacionado com floculação ou morfologia de colônia, testamos se LOH pode estar relacionada com alguma consequência fenotípica benéfica à JAY270. Dentre onze linhagens LOH testadas em ensaios fermentativos de competição direta com o parental, encontramos uma com ganho de competitividade durante a fermentação

Abstract: Flocculation is a process of cellular aggregation observed in several Saccharomyces cerevisiae strains which results in sedimentation, impairing the fermentation yield and the operation of Brazilian bioethanol distilleries. Most strains used in this industry, including the PE-2/JAY270...

Abstract: Flocculation is a process of cellular aggregation observed in several Saccharomyces cerevisiae strains which results in sedimentation, impairing the fermentation yield and the operation of Brazilian bioethanol distilleries. Most strains used in this industry, including the PE-2/JAY270 strain, were selected for their inability to flocculate. The genetic control of flocculation is well characterized and several genes were associated with this phenomenon, including the FLO family of genes. We previously observed that the JAY291 strain (derivative haploid of JAY270) does not flocculate, despite having the functional allele of the positive regulator of flocculation FLO8, suggesting that its phenotype involves another step of this pathway. Analysis of the F2 progeny from crossing JAY291 with the laboratory strain S288c (flo8-1) revealed the phenotypic ratio of ~1:8 (flocculent/non-flocculent), expected for a trait controlled by three unlinked genes. We sequenced the genomes of eight flocculent F2 individuals segregating ~40.000 SNPs that exist between S288c and JAY291. The sequences were compared to each other to localize regions that co-segregated with the flocculation. This preliminary mapping was refined by PCR-RFLP, revealing a second gene, FLO1, which is absent in JAY291. To identify the third gene, we phenotypically analyzed new F2 haploids segregating from a cross between S288c (FLO8::KanMX4 FLO1::HphMX4) and JAY291 (FLO8 flo1?), among which FLO1:HphMX4 individuals were separated into two bulks (flocculent and non-flocculent) and sequenced. Allele frequencies S288c or JAY291 in bulks were interrogated and statistically validated, revealing a third gene strongly associated with the phenotype: MSS11 (transcription factor involved in flocculation). We also found twelve other loci containing minor effect genes, but acting as modifiers of the phenotype. In independent experiments, we observed alterations in the colony morphology of JAY270 and a transition from its typical rough to smooth phenotype, also associated with a low degree of flocculation. This type of colony is often found in the industry. Interestingly the same phenotype was observed crossing specific haploids derivatives of JAY270. The crosses suggested that the phenotype was controlled by a single gene, but diploid specific. Mapping genomes of haploids of JAY270 revealed the gene responsible for the altered phenotype: ACE2, involved in cell separation. The JAY270 is heterozygous to a frameshift mutation in the ACE2 (ACE2/ace2-7A). The rough phenotype occurs by mitotic recombination associated with loss-of-heterozygosity (LOH), producing cells with two mutated copies of this gene. x To avoid future industrial problems caused by sedimentation of rough strains derived from LOH in the ACE2 region, the ace2-7A defect was repaired in the JAY270 genome. The diploid FGY050 (ura3?/ura3?), derived from JAY270 and auxotrophic to uracil was used as a platform. The developed strain has two copies of the ACE2 wild-type allele (ACE2/ACE2) and is therefore unable to become roughened by recombination. Finally, in a study unrelated to flocculation or colony morphology, we tested whether LOH may be associated with some phenotypic consequence beneficial to the JAY270. Out of eleven LOH strains tested in fermentative assays of direct competition against their parental strain, we found one with gain in competitiveness during fermentation