Orientador: Adriana Franco Paes Leme

Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba

Resumo: O carcinoma espinocelular oral (CEC oral) é a neoplasia maligna de cabeça e pescoço mais frequente e com grande morbidade. As melhorias nos protocolos terapêuticos não têm sido associadas com a melhora no prognóstico dos pacientes nas últimas décadas. Além disso, a taxa de descoberta de...

Resumo: O carcinoma espinocelular oral (CEC oral) é a neoplasia maligna de cabeça e pescoço mais frequente e com grande morbidade. As melhorias nos protocolos terapêuticos não têm sido associadas com a melhora no prognóstico dos pacientes nas últimas décadas. Além disso, a taxa de descoberta de biomarcadores com utilização clínica de rotina ainda é um desafio para a grande maioria dos cânceres, inclusive para o CEC oral. Neste cenário, a associação da microdissecção a laser (ML) a espectrometria de massas (MS) tem sido considerada uma abordagem com alta robustez na descoberta de biomarcadores para o câncer. Diante disso, o objetivo deste estudo foi identificar potenciais biomarcadores para o CEC oral através da associação da ML a MS além de buscar possíveis mecanismos biológicos associados aos principais biomarcadores identificados com auxílio de ferramentas de bioinformática. Para isso, 10 pares de amostras teciduais frescas de CEC oral e mucosa oral normal foram obtidos para isolamento por ML para análise por cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas em tandem (LC-MS/MS) seguida por análises de bioinformática. Foram identificadas 2529 proteínas e entre essas, 107 proteínas apresentaram maior expressão nas amostras de CEC oral comparadas com a mucosa oral normal (teste t Student não-pareado, p<0,05 e razão >1,5). Os dados também foram submetidos às análises multivariadas pelos modelos Partial Least Squares Discriminant Analysis (PLS-DA) e Support Vector Machine (SVM) que indicaram, respectivamente, um painel de 40 e 70 potenciais biomarcadores. No geral, as análises pelo Ingenuity, KEGG (banco de dados Enciclopédia Kyoto para genes e genomas) e Gene Ontology mostraram que os processos mais significantes foram relacionados à sinalização célula-célula, a replicação do DNA, a recombinação e ao reparo, a adesão focal, a regulação do citoesqueleto de actina e a interação do receptor da matriz extracelular, entre outras. O fator eucariótico de elongação delta 1 (EEF1D) foi à proteína indicada para validação por ter apresentado reprodutibilidade de expressão entre as amostras de CEC oral, alta significância estatística segundo o teste t Student, expressão aumentada em CEC oral, por ter sido indicada como um marcador de classe na análise por PLS-DA e porque a sua função biológica ainda não foi investigada para esta neoplasia. Os resultados dos ensaios de validação confirmaram uma maior expressão de EEF1D por western blot utilizando-se células SCC-9 e tecido tumoral originado de modelo ortotópico. Além disso, uma intensidade de marcação maior para EEF1D foi observada em CEC oral pela validação por imuno-histoquímica (IHQ). Portanto, esse estudo combinou técnicas de ML, MS e bioinformática para a identificação de potenciais biomarcadores sendo que a proteína EEF1D foi considerada um potencial biomarcador para o CEC oral e validada por WB e IHQ podendo futuramente ser indicada também para validação em estudos translacionais

Abstract: The oral squamous cell carcinoma (OSCC) is a malignant head and neck with more frequency of occurrence and with greater morbidity. Improvements in treatment protocols have not been associated with improved prognosis of patients in recent decades. Furthermore, the rate of discovery of...

Abstract: The oral squamous cell carcinoma (OSCC) is a malignant head and neck with more frequency of occurrence and with greater morbidity. Improvements in treatment protocols have not been associated with improved prognosis of patients in recent decades. Furthermore, the rate of discovery of biomarkers with clinical routine use is still a challenge for the large majority of cancers, including OSCC. In this scenario, the combination of laser microdissection (LM) and mass spectrometry (MS) has been considered an approach with high robustness to biomarker discovery for cancer. Thus, the aim of this study was to identify potential biomarkers for OSCC through the association of the LM, MS and bioinformatics aiming at exploring biological mechanisms associated with major candidate biomarkers identified. For this, 10 pairs of fresh tissue samples of OSCC and normal oral mucosa were obtained for isolation by LM for analysis by liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) and bioinformatics analysis. 2529 proteins were identified and among these, 107 proteins have higher expression in oral SCC samples compared with normal oral mucosa (unpaired Student's t test, p <0.05 and ratio >1.5). The data were also submitted to multivariate models by Partial Least Squares Discriminant Analysis (PLS-DA) and Support Vector Machine (SVM) that, respectively, indicated a panel of 40 and 70 potential biomarkers. Overall, the Ingenuity analysis, KEGG (Kyoto Encyclopedia database for genes and genomes) and Gene Ontology showed that the most significant processes were related to cell-cell signaling, DNA replication, recombination and repair, adhesion focal, regulation of acting cytoskeleton and the interaction of the receptor extracellular matrix. The eukaryotic elongation factor 1 delta (EEF1D) was the protein indicated to validation because presented reproducibility of expression between OSCC samples, high statistical significance according to the Student t test, increased expression in OSCC, having been appointed as a class marker analysis for PLS-DA and because its biological function has not yet been investigated for this cancer. The higher expression of EEF1D was confirmed by western blot using proteins extracted from SCC-9 cells and tumor tissue originated from orthotropic model. Moreover, a higher marking intensity was observed in EEF1D for OSCC for validation by immunohistochemistry (IHC). Therefore, this study combined techniques ML, MS, and bioinformatics to identify potential biomarkers and EEF1D was the protein identified as a potential biomarker for OSCC and validated by WB and IHC and may also be indicated for validation in future translational studies