Resumo: MicroRNAs são moléculas recém-descobertas de RNA não-codificadores que possuem de 21 a 24 nucleotídeos e que regulam a expressão após a transcrição dos genes alvo. Essa regulação pode ser realizada através da inibição da tradução ou da degradação do RNA mensageiro. Os miRNAs estão envolvidos em vários processo biológicos como, diferenciação celular e desenvolvimento embrionário, além de apresentarem expressão tecido e tempo-específica. Eles podem regular a expressão de pelo menos 1/3 de todos os genes humanos e estão envolvidos com a regulação do metabolismo e da apoptose. Os miRNAs são a chave como reguladores pós-transcricionais da neurogênese; estudos mostram que eles possuem a expressão associada com a transição entre proliferação e diferenciação e também tem expressão constitutiva em neurônios maduros, evidenciando o envolvimento dessas moléculas com o desenvolvimento do sistema nervoso central (SNC). Outros miRNAs estão sendo estudados e verifica-se que eles agem como reguladores de genes envolvidos em doenças como Alzheimer, Parkinson e, provavelmente, também devam possuir um papel na regulação das epilepsias. No primeiro trabalho, apresentado no segundo capítulo, investigamos o papel dos miRNAs no desenvolvimento do SNC através da quantificação de 104 miRNAs em cérebros em desenvolvimento de camundongos. No segundo trabalho, apresentado no terceiro capítulo, para analisarmos o papel dos miRNAs na epilepsia de lobo temporal, verificamos se havia presença de miRNAs com expressão diferenciada entre tecidos removidos de pacientes que se submeteram a cirurgia de hipocampectomia e tecidos normais provenientes de autópsias. Para ambos os experimentos, foram extraídos os RNAs dos tecidos e quantificados por PCR em tempo real com o kit MicroRNA Assay baseado em iniciadores com estrutura em stem loop. Nos camundongos, análises de bioinformática encontraram quatro cluster de acordo com a expressão dos miRNAs. Um cluster (C1) com 12 miRNAs (miR-9; miR-17- 5p; miR-124a; miR-125a; miR-125b;miR-130a; miR-140; miR-181a; miR-199a; miR-205; miR-214; miR-301) apresentou expressão com diferença significativa durante o desenvolvimento. Nos tecidos dos pacientes, após a análise de bioinformática, encontramos três miRNAs com expressão diferenciada entre pacientes e controle (miR-29b, miR-30d e let-7). Em ambos os experimentos analisamos os possíveis genes alvo desse miRNAs. Nos camundongos, nossos resultados sugerem a presença de um padrão específico de expressão no cluster C1, indicando que esses miRNAs possam ter um papel na regulação de genes envolvidos na neurogênese. Nos tecidos humanos, os genes alvo encontrados estão envolvidos, principalmente, em proliferação celular, neurogênese e apoptose, indicando uma provável atuação dos miRNAs na regulação de genes que estão envolvidos na epilepsia de lobo temporal Ver menos

Abstract: MicroRNAs are a new class of small RNA molecules (21-24 nucleotide-long) that negatively regulate gene expression either by translational repression or target mRNA degradation. It is believed that about 30% of all human genes are targeted by these molecules. MiRNAs are involved in many important biological processes including cell differentiation, embryonic development and central nervous system formation, besides they showed specific temporal-space expression. They can regulate 1/3 of human genes and are involved in metabolism and apoptosis. miRNAs are the key as neurogenesis postranscriptional regulation; studies previous indicates miRNA expression associate with proliferation and differentiation in development of central nervous system (CNS) and housekeeping expression in mature neurons. They are involved in several diseases as Alzkeimer's and Parkinson and may have a role in epilepsy regulation. In second chapter, we analyze the miRNA expression in mouse brain during four stages of CNS development; in third chapter, we analyze hippocampal tissue of four patients who underwent selective resection of the mesial temporal structures for the treatment of clinically refractory seizures. In addition we used control samples from autopsy (n=4) for comparison. In both experiments, total RNA was isolated from tissues and used in real-time PCR reactions with TaqMan¿ microRNA assays (Applied Biosystems) to quantify 104 (mouse brain) or 157 (human tissue) different miRNAs. In mouse brain analysis, we were able to identified four different clusters (C1, C2, C3 and C4) of miRNAs expression. Significant differences in expression during development were observed only in miRNAs included in C1. Our results suggest the presence of a specific expression pattern in C1, indicating that these miRNAs could have an important role in gene regulation during neurogenesis. We found a significant decrease (p<0,05) in expression of 12 miRNAs (miR-9; miR-17-5p; miR-124a; miR-125a; miR-125b;miR-130a; miR-140; miR-181a; miR-199a; miR-205; miR-214; miR- 301) belonging to cluster C1 in latter stages of development. Computational target identification showed that 10 of the 12 miRNAs present in C1 could be involved in neurogenesis. In human tissues, bioinformatics analyzes identified three miRNAs species which were differently expressed in patients as compared to controls: let7a was over expressed in patients (4 fold increased), miR-29b and miR-30d were down-regulated in patients (2.5 fold and 0.5 fold decreased, respectively). Possible target genes for let-7a are NME6 and NCAM1 (which would be down-regulated in patients); for miR-29b is MCL-1 and for miR30d are CTNND2, LGI1 and SON (which would be up-regulated in patients). We have identified three different miRNA species differently expressed in hippocampal sclerosis. Gene functions related to the possible miRNA targets are involved mainly with cell proliferation, neurogenesis, cell adhesion and apoptosis. Our results indicate new molecular targets which should be explored in additional studies addressing miRNA regulation in hippocampal sclerosis Ver menos