Produção, purificação, caracterização e aplicação de transglutaminase de Streptomyces sp. CBMAI 837
Juliana Alves Macedo
TESE
Português
T/UNICAMP M151p
[Production, purification, characterization and application of transglutaminase from Streptomyces sp. CBMAI 837]
Campinas, SP : [s.n.], 2009.
141 p. : il.
Orientadores: Helia Harumi Sato , Lara Durães Sette
Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos
Resumo: A transglutaminase (TGase) (EC 2.3.2.13; proteina-glutamina ?-glutaminiltransferase) é uma enzima capaz de catalisar reações de transferência de grupos acil utilizando resíduos de glutamina das ligações peptídicas de proteínas como doadores de grupos acil, e diversas aminas primárias como...
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Resumo: A transglutaminase (TGase) (EC 2.3.2.13; proteina-glutamina ?-glutaminiltransferase) é uma enzima capaz de catalisar reações de transferência de grupos acil utilizando resíduos de glutamina das ligações peptídicas de proteínas como doadores de grupos acil, e diversas aminas primárias como receptores. As ligações covalentes cruzadas entre inúmeras proteínas e peptídeos pela transglutaminase promovem mudanças nas propriedades de proteínas de alimentos. Por essa razão, a transglutaminase é amplamente utilizada nas indústrias de processamento de alimentos para o desenvolvimento de novos produtos e modificação de características como: viscosidade, capacidade emulsificante e valores nutricionais. Uma cepa de Actinomyceto, isolada de amostras de solo brasileiro, foi investigada taxonomicamente por uma combinação de técnicas moleculares e morfológicas, resultando na conclusão de que a cepa pertence ao gênero Streptomyces sp. A cepa, chamada de Streptomyces sp. CBMAI 837 produziu transglutaminase quando cultivada a 30°C por cinco dias, em agitador rotatório, no meio de fermentação otimizado, composto por: 0,2% KH2PO4, 0,1% MgSO4.7H2O, 2% farinha de soja, 2% amido de batata, 0,2% glicose, e 2% peptona, atingindo uma atividade enzimática de 1,37 U.mL-1. A transglutaminase foi purificada cerca de 5 vezes através de duas passagens cromatográficas sucessivas em uma coluna de filtração em gel Sephadex G-75, com 17% de recuperação. A purificação da proteína foi comprovada por homogeneidade eletroforética em SDS-PAGE. A massa molar da TGase foi estimada em cerca de 45 kDa. A transglutaminase de Streptomyces sp CBMAI 837, tanto na forma bruta quanto purificada, apresentou atividade enzimática ótima em pH 6,0-6,5, e em 35-40°C. Um segundo pico de atividade ótima foi observado em pH 10,0 na enzima no estado bruto. Ambas as formas da enzima foram estáveis na faixa de pH de 4,5 a 8,0 e até 45°C. A transglutaminase na forma bruta e purificada mostrou-se independente de íons cálcio, mas foi ativada na presença de K+, Ba2+, e Co2+; e inibida por Cu2+ e Hg2; o que sugere a presença de um grupo tiol no sítio ativo da enzima. A TGase purificada apresentou um Km de 6,37 mM e um Vmax de 1,70 U/mL, enquanto a enzima bruta apresentou Km de 6,52 mM e um Vmax de 1,35 U/mL para o substrato N-carbobenzoxi-L-glutaminil-glicina. A influência da transglutaminase de Streptomyces sp CBMAI 837 bruta, nas propriedades de géis ácidos de caseinato de sódio foi investigada, tendo como parâmetro géis preparados com a TGase comercial (Ajinomoto Inc.). Os géis com a enzima comercial tiveram um valor de módulo de elasticidade maior, porém, dependendo da concentração de proteína, estes foram menos deformáveis. Os géis com enzima bruta de Streptomyces sp. CBMAI 837 se mostraram muito mais rígidos e menos elásticos. Resultados da eletroforese indicaram que a enzima comercial promoveu a formação de polímeros de proteínas de massa molecular mais alta do que a enzima de Streptomyces sp. CBMAI 837. Os testes de microscopia eletrônica de varredura e da capacidade de retenção de água mostraram que características particulares de cada um dos géis poderiam estar associadas ao tipo específico de interação promovida por cada uma das amostras enzimáticas testadas
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Abstract: Transglutaminase (EC 2.3.2.13; protein-glutamine ?-glutaminyltransferase) is an enzyme that catalysis an acyl transfer reaction using protein or peptide-bond glutamine residues as acyl donors and several primary amines as receptors. The covalent cross-links between a number of proteins and...
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Abstract: Transglutaminase (EC 2.3.2.13; protein-glutamine ?-glutaminyltransferase) is an enzyme that catalysis an acyl transfer reaction using protein or peptide-bond glutamine residues as acyl donors and several primary amines as receptors. The covalent cross-links between a number of proteins and peptides introduced by transglutaminase promote modification of the functional properties of the food proteins. Therefore, transglutaminase are widely used by food-processing industries for the purpose of new product development, modification of the product properties such as viscosity, emulsification foaming and nutritional values. An actinomycete strain, isolated from Brazilian soil, was taxonomically investigated using a combination of molecular and morphological basedmethods, resulting on the conclusion that the strain belongs to the genus Streptomyces sp. The strain, named Streptomyces sp. CBMAI 837, produce transglutaminase when cultivated at 30°C for 5 days at 200 rpm in a rotatory shaker, on the optimized fermentation medium composed of 0.2% KH2PO4, 0.1% MgSO4.7H2O, 2% soybean flour, 2% potato starch, 0.2% glucose, and 2% peptone, with a enzymatic activity of 1.37 U.mL-1. The enzyme purification was performed by of two successive chromatographies on Sephadex G-75 columns with yields of 48% and 17%, respectively. The protein purification was successfully achieved to electrophoretical homogeneity on SDS-PAGE. The molecular mass of the MTGase was estimated to be about 45 kDa. The enzyme from Streptomyces sp., in both crude and pure forms, exhibited optimal activity in the 6.0-6.5 pH range and at 35-40°C. A second maximum of activity was observed at pH 10.0 on the crude Streptomyces sp. enzyme. Both forms of transglutaminase were stable over the pH range from 4.5 to 8.0 and up to 45°C. The activities of all the TGase samples were independent of Ca+2 concentration, but they were elevated in the presence of K+, Ba2+, and Co2+ and inhibited by Cu2+ and Hg2+, which suggests the presence of a thiol group in the TGase¿s active site. The purified enzyme presented Km of 6.37 mM and Vmax of 1.7 U/mL, while the crude enzyme demonstrated Km of 6.52 mM and Vmax of 1.35 U/mL. The influence of the transglutaminase on acid-gel properties was studied. Texture parameters showed that the commercial TGase (Ajinomoto Inc.) gels had greater values of elasticity modulus and could promote the formation of more elastic and soft food systems, while addition of the crude TGase of Streptomyces sp. CBMAI 837 to the gel led to the formation of more rigid and less elastic gels. The electrophoresis showed that the commercial TG enzyme in this system promoted higher molecular mass protein polymers than the enzyme from Streptomyces sp. CBMAI 837. Microscopy and water holding capacity (WHC) observations showed that all the gel characteristics could be associated to specific interactions promoted by each TGase tested
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Sato, Helia Harumi, 1952-
Orientador
Sette, Lara Durães, 1971-
Coorientador
Santana, Maria Helena Andrade, 1951-
Avaliador
Silva, Roberto da
Avaliador
Cunha, Rosiane Lopes da, 1967-
Avaliador
Carmona, Eleonora Cano
Avaliador
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