Resumo: As NimA-related kinases (Neks) são uma família de serina/treonina e tirosina quinases altamente conservadas com funções relacionadas na integração do ciclo celular com sinalização de proliferação, resposta ao dano de DNA, metabolismo do cílio primário, progressão da mitose, além de funções relacionadas à inflamação, homeostase mitocondrial e redox. O eixo mitótico das NEKs está relacionado com as funções das NEK6, NEK7 e NEK9. A NEK6 é um dos menores membros das NEKs, sua ativação e regulação na progressão da mitose não estão completamente elucidados. A atividade quinase da NEK6 é regulada após estresse genotóxico através da fosforilação pela CHK1 e CHK2, no entanto o resíduo fosforilado não foi identificado, apenas foi observado que o resíduo fosforilado está localizado no N-terminal da NEK6 (aminoácido 1-80). Inicialmente hipotetizamos que o resíduo fosforilado da NEK6 pela CHK1 e CHK2 é a serina 37, por este ser o único resíduo dentro do N-terminal identificado como fosfopeptídeo experimentalmente, entretanto, não foram identificadas alterações na atividade quinase da NEK6 em mutantes fosfomiméticas e fosfodeficiêntes da serina 37. Dessa forma, hipotetizamos que a serina 37 pode regular a afinidade da NEK6 com alguns interatores sem alterar sua atividade quinase. Realizamos uma análise de sítios funcionais e regulatórios da NEK6 utilizando ferramentas in silico, e obtivemos um modelo da estrutura de alta resolução da NEK6 utilizando o software AlphaFold2. Foi possível observar através da análise dos modelos estruturais da NEK6 que a serina 37 não está na interface de homodimerização, corroborando a ideia de que a fosforilação da serina 37 não afeta a homodimerização e autoativação da NEK6, e consequentemente sua atividade quinase. Posteriormente, analisamos se a serina 37 possui relação com a regulação da homodimerização, autoativação, localização celular e estabilidade da NEK6. Utilizamos vetores de expressão em células de mamíferos clonados com a sequência selvagem da NEK6 de Homo sapiens (313 aminoácidos), com mutações fosfomiméticas e fosfodeficiêntes na serina 37 fusionadas com FLAG (pcDNA3.1) e GFP (pGFP). As construções fusionadas ao FLAG e GFP foram cotransfectadas em células HEK293T por 30 horas. Utilizamos a fluorescência do GFP para analisar a localização celular da NEK6 através do microscópio de fluorescência, e realizamos a imunoprecipitação das construções fusionadas ao FLAG utilizando beads de agarose conjugadas com IgG anti-FLAG. Analisamos a homodimerização pela coprecipitação da GFP-NEK6 com o imunoprecipitado de FLAG-NEK6 e a auto-ativação e estabilidade por western blot. Nossos dados indicam que a NEK6 possui capacidade de homodimerização e auto-ativação, nos quais não são afetadas pela serina 37. A estabilidade da NEK6 também não foi afetada pela serina 37. Identificamos que a serina 37 e a interação com a NEK9 regulam a localização celular da NEK6, e a serina 37 está relacionada com a regulação da afinidade da NEK6 com a Beta Tubulina e a Gama Tubulina. Em uma análise filogenética nós identificamos que a Nek6 surgiu em vertebrados após uma duplicação gênica, e a serina 37 surgiu nos mamíferos. Dessa forma, nossos dados indicam que a serina 37 da NEK6 regula sua localização celular e afinidade a interatores sem modificar sua atividade quinase, provavelmente sendo o resíduo fosforilado pela CHK1 e CHK2 após estresse genotóxico, no qual pôde ter conferido alguma vantagem evolutiva aos mamíferos. Identificamos também que a serina 37 regula um fenótipo que aparentemente são centrossomos amplificados, sendo necessário a confirmação através da análise da colocalização da NEK6 com proteínas centrossomais através de imunofluorescência em microscópio de fluorescência Ver menos

Abstract: NEKs are a family of serine/threonine and tyrosine kinases highly conserved with functions related in the the cell cycle integration with proliferation signaling, DNA damage response, primary cilium metabolism, mitotic progression, as well as functions related to inflammation, mitochondrial homeostasis and redox. The mitotic axis of NEKs is related to the NEK6, NEK7 and NEK9 functions. NEK6 is one of the smallest members of NEKs, its activation and regulation in mitotic progression are not completely elucidated. The kinase activity of NEK6 is regulated after genotoxic stress through phosphorylation by CHK1 and CHK2, however the phosphorylated residue was not identified, it was only observed that the phosphorylated residue is located at the N-terminus of NEK6 (amino acid 1-80). We initially hypothesized that serine 37 is the residue phosphorylated in NEK6 by CHK1 and CHK2, since this is the only residue identified experimentally as a phosphopeptide within the N-terminus. However, no changes in the NEK6 kinase activity were identified in serine 37 phosphomimetic and phosphodeficient mutants. Thus, serine 37 may regulate the affinity of NEK6 with some interactors without altering its kinase activity. We performed an analysis of functional and regulatory sites of NEK6 using in silico tools and obtained a high-resolution model of the NEK6 structure using AlphaFold2 software. It was possible to observe that serine 37 is not in the homodimerization interface of the modeled NEK6, corroborating the idea that serine 37 phosphorylation does not affect the homodimerization and autoactivation of NEK6, and consequently its kinase activity. Subsequently, we analyzed whether serine 37 is related to the regulation of homodimerization, autoactivation, cellular localization and stability of NEK6. We used mammalian cell expression vectors cloned with the wild type NEK6 sequence of the Homo sapiens (313 aminoacids) and with serine 37 phosphomimetic and phosphodeficient mutations fused to FLAG (pcDNA3.1) and GFP (pGFP). The constructions were cotransfected into HEK293T cells for 30 hours. We used GFP fluorescence to analyze the NEK6 cellular localization with fluorescence microscopy, and performed immunoprecipitation of the FLAG-fused constructs using agarose beads conjugated with anti-FLAG IgG. We analyzed homodimerization by coprecipitation of GFP-NEK6 with immunoprecipitation of FLAG-NEK6, and autoactivation and stability by western blot. Our data indicates that NEK6 can form homodimerization and autoactivation, which are not affected by serine 37. NEK6 stability was also not affected by serine 37. We identified that serine 37 and the interaction with NEK9 regulates NEK6 cellular localization, and serine 37 is related to the regulation of NEK6 affinity to beta tubulin and gamma tubulin. In a phylogenetic analysis, Nek6 arose in vertebrates after a gene duplication, and we identified that serine 37 arose in mammals. Thus, our data indicates that serine 37 of NEK6 regulates its affinity to interactors and cellular localization without modify its kinase activity, probably being the residue phosphorylated by CHK1 and CHK2 after genotoxic stress, in which it may have conferred some evolutionary advantage to mammals. We also identified that serine 37 regulates a phenotype that apparently are amplified centrosomes, which requires confirmation by analyzing the colocalization of NEK6 with centrosome proteins through immunofluorescence microscope Ver menos