Resumo: Nos últimos anos, a urgência em se desenvolver alternativas mais sustentáveis para a substituição de derivados de petróleo tem crescido consideravelmente. Essa demanda é impulsionada por fatores como a flutuação do preço do petróleo bruto, redução irreversível das reservas, rápido aumento da demanda global de energia, além das preocupações relacionadas ao desequilíbrio ambiental gerado pela extração e utilização dessas substâncias. Portanto, o estudo aprofundado de rotas biológicas capazes de realizar a produção de hidrocarbonetos, componentes majoritários do petróleo, a partir de matéria prima vegetal se torna uma interessante opção. A descoberta de peroxigenases P450 ganhou notoriedade devido à capacidade destas de catalisar a síntese de alcenos com uma dupla ligação no carbono ? a partir da reação de descarboxilação de ácido graxo livre. Apesar disso, ainda pouco se sabe sobre essas proteínas, denominadas OleTs, e alguns desafios precisam ser superados, como a obtenção de enzimas com atividade preferencial de descarboxilação sobre a hidroxilação, visto que peroxigenases P450 podem catalisar ambas reações. Nesse sentido, a compreensão dos mecanismos de reação das descarboxilases P450, assim como a descoberta de diferentes enzimas com esta atividade, são cruciais para o desenvolvimento de novas tecnologias. A presente dissertação propôs, portanto, a investigação aprofundada de novas peroxigenases P450 putativas com possíveis funções descarboxilases e suas aplicações na produção in vitro e in vivo de alcenos. As enzimas investigadas foram selecionadas a partir de análises in-silico por meio de redes de similaridade de sequências (SSN), em que clusteres isofuncionais foram definidos e utilizados como nichos para a busca de peroxigenases com atividade de descarboxilação. Os dados obtidos a partir de caracterizações bioquímicas indicou que as enzimas estudadas apresentam especificidades diferentes entre elas e outras reportadas na literatura. Como destaque, a peroxigenase de Aeromicrobium yanjiei (OleTAer), de um cluster nunca explorado, demonstrou grande capacidade descarboxilase, com taxas de conversão de diferentes ácidos graxos e que superam, inclusive, enzimas já descritas na literatura. Esse dado possibilitou a utilização dessa OleT na construção de cepas da levedura oleaginosa Yarrowia lipolytica para a produção in vivo de alcenos. O presente trabalho demonstrou, portanto, o potencial das enzimas descarboxilases da família CYP152 para a produção sustentável (in vitro e in vivo) de hidrocarbonetos a partir de ácidos graxos Ver menos

Abstract: The urgency to develop more sustainable alternatives to replace petroleum derivatives has grown considerably in recent years. This demand is driven by fluctuations in the price of crude oil, irreversible reduction in reserves, rapid increase in global energy demand, and concerns related to the environmental imbalance generated by the extraction and use of these substances. Thus, the in-depth study of biological routes capable of producing hydrocarbons, the main petroleum component, from vegetable raw materials becomes an interesting option. The discovery of P450 peroxygenase proteins gained notoriety due to their ability to catalyze the removal of oxygen from medium- to long-chain fatty acids, producing hydrocarbons. These enzymes, known as OleTs, catalyze the synthesis of alkenes with a double bond at carbon ?, from the free fatty acid decarboxylation reaction. However, little is known about these proteins and some challenges need to be overcome, such as obtaining enzymes with preferential decarboxylation activity over hydroxylation, since P450 peroxygenases can catalyze both reactions. In this sense, understanding the reaction mechanisms of P450 decarboxylases and the discovery of different enzymes with this activity is crucial for developing new technologies. The present dissertation therefore proposed the in-depth investigation of new putative P450 peroxygenases with possible decarboxylase functions and their applications in the in vitro and in vivo production of alkenes. The investigated enzymes were selected from in-silico analyses using sequence similarity networks (SSN). This analysis defined isofunctional clusters and used as niches to search for peroxygenases with decarboxylation activity. The data obtained from biochemical characterizations indicated that the enzymes studied have different specificities between them and others reported in the literature. As a highlight, the peroxygenase from Aeromicrobium yanjiei (OleTAer), from a cluster never explored, demonstrated great decarboxylase capacity, with conversion rates of different fatty acids that even surpass data already described in the literature. These results made it possible to use this OleT in the construction of strains of the oleaginous yeast Yarrowia lipolytica for the in vivo production of alkenes. Therefore, the present work demonstrated the potential of decarboxylase enzymes from the CYP152 family for the sustainable production (in vitro and in vivo) of hydrocarbons from fatty acids Ver menos