Resumo: Introdução: NIMA (Never In Mitosis, gene A)-related kinase-6 (NEK6) pertence a uma superfamília de proteínas composta por 11 membros de quinases relacionadas a NIMA. As funções da NEK6 são pouco estudadas, exceto por sua participação já evidenciada no ciclo celular. A literatura tem mostrado sua relevância no câncer de próstata resistente à castração (CPRC), evidenciando seu papel central no crescimento do tumor independente de andrógeno, sugerindo que NEK6 regula vias de sobrevivência celular, as quais não estão relacionadas com sua função no ciclo celular. No entanto, ainda não está claro quais são essas vias e mecanismos regulados por NEK6 que a fazem participar do CPRC. Objetivo: O objetivo desse estudo foi explorar a NEK6 no CPRC, avaliando os efeitos celulares na ausência da sua expressão e inibição, bem como identificar os mecanismos moleculares de sobrevivência que NEK6 regula nesse câncer. Além disso, também avaliamos a relevância da depleção e/ou inibição de NEK6 no contexto do tratamento de quimioterápicos utilizados no CPRC, tais como cisplatina e docetaxel, e do composto natural anti-tumorigênico, resveratrol. Material e métodos: Foram geradas células nocautes de NEK6 nas linhagens celulares DU-145 e PC-3 utilizando o sistema CRISPR/Cas9. O uso de um inibidor específico de NEK6 também foi testado nas células DU-145 e PC-3. Ensaios funcionais para avaliar viabilidade, capacidade clonogênica, morte celular, migração, geração de Espécies Reativas de Oxigênio (ROS), permeabilidade da membrana mitocondrial foram realizados nessas células. Avaliação da expressão a nível de RNA mensageiro e proteico de genes relacionados à progressão e quimioresistência no câncer de próstata foram realizados. Resultados: Os nocautes de NEK6 diminuiram a capacidade clonogênica, proliferação, viabilidade celular e a atividade mitocondrial. A depleção de NEK6 aumentou o nível de ROS intracelular; diminuiu a expressão das defesas antioxidantes (SOD1, SOD2 e PRDX3); aumentou a fosforilação de JNK, uma quinase responsiva ao estresse; e aumentou os marcadores de dano ao DNA (p-ATM e ?H2AX). A superexpressão exógena de NEK6 também aumentou a expressão dessas mesmas defesas antioxidantes e diminui ?H2AX. A depleção de NEK6 induziu a morte celular por apoptose e reduz a proteína anti-apoptótica Bcl-2. As células com falta de NEK6 têm mais sensibilidade à cisplatina. NEK6 regulou a localização nuclear de NF-?B2, sugerindo que NEK6 pode regular a atividade transcricional de NF-?B2. Portanto, NEK6 altera o equilíbrio redox, regula a expressão de proteínas antioxidantes e danos ao DNA, e sua ausência induz a morte de células DU-145. Observamos que a inibição de NEK6 sensibilizou as células DU-145 ao tratamento com docetaxel, induziu marcadores significativos de apoptose (clivagem de PARP1, BAK), reduziu as vias de sobrevivência (p65 fosforilado) e migração celular (TJP1). O inibidor de NEK6, individualmente, foi capaz de reduzir significativamente as expressões de Bcl-xL, Bad fosforilado e TJP1. O inibidor de NEK6 exibiu um IC50 atraente em DU-145 e PC-3, podendo ser um composto interessante a ser explorado no câncer de próstata. O cotratamento com docetaxel e inibidor de NEK6 reduziu significativamente a formação de colônias e a migração celular. O nocaute de NEK6 em células DU-145 e PC-3 sensibiliza as células ao tratamento com docetaxel. Resveratrol também foi capaz de inibir a expressão de NEK6 e HK2. Foi observado que NEK6 regula a expressão da enzima glicolítica HK2, conectando NEK6 com vias metabólicas no CRPC. Sugere-se que o eixo de sinalização NEK6-HK2 pode ser um possível mecanismo de regulação do resveratrol. Conclusão: NEK6 pode ser um alvo estratégico no câncer de próstata e os inidores de NEK6 devem ser explorados, bem como seu uso na combinação com quimioterápicos Ver menos

Abstract: Introduction: NIMA (Never In Mitosis, gene A)-related kinase-6 (NEK6) belongs to a superfamily of 11 members of NIMA-related kinases. The functions of NEK6 are little studied, except for its already evidenced participation in the cell cycle. The literature has shown its relevance in castration-resistant prostate cancer (CRPC), evidencing its central role in androgen-independent tumor growth, suggesting that NEK6 regulates cell survival pathways. However, it is still unclear which these pathways and mechanisms regulated by NEK6 make it participate in the CPRC. Aim: This study aimed to explore NEK6 in CRPC, evaluating the cellular effects in the absence of its expression and inhibition, as well as identifying the molecular survival mechanisms that NEK6 regulates in this cancer. In addition, we also evaluated the relevance of NEK6 depletion and/or inhibition in the chemotherapy treatment used in CPRC, such as cisplatin and docetaxel, and the natural anti-tumor compound, resveratrol. Material and methods: NEK6 knockout cells were generated in DU-145 and PC-3 cell lines using the CRISPR/Cas9 system. The use of a specific NEK6 inhibitor was also tested on DU-145 and PC-3 cells. Functional assays to evaluate viability, clonogenic capacity, cell death, migration, generation of Reactive Oxygen Species (ROS), and permeability of the mitochondrial membrane were performed in these cells. Evaluation of expression at the level of messenger and protein RNA of genes related to progression and chemoresistance in prostate cancer cells were performed. Results: NEK6 knockouts decreased clonogenic capacity, proliferation, cell viability, and mitochondrial activity. NEK6 depletion increased the level of intracellular ROS, decreased expression of antioxidant defenses (SOD1, SOD2, and PRDX3), increased phosphorylation of JNK, a stress-responsive kinase, and increased DNA damage markers (p-ATM and ?H2AX). Overexpression of NEK6 also increased the antioxidant defenses and decreased DNA damage. NEK6 lack induced apoptosis reduced Bcl-2 protein. DU-145 cells lacking NEK6 are more sensitive to cisplatin treatment. NEK6 modulated the nuclear localization of NF-?B2. Therefore, NEK6 alters redox balance, regulates antioxidant protein expression and DNA damage, and its absence induces DU-145 cell death. We observed that NEK6 inhibition sensitized DU-145 cells to docetaxel treatment, induced significant markers of apoptosis (PARP1 cleavage, BAK), reduced survival (phosphorylated p65) and cell migration (TJP1) pathways. The NEK6 inhibitor, individually, was able to significantly reduce Bcl-xL, phosphorylated Bad, and TJP1 8 expressions. The NEK6 inhibitor exhibited an attractive IC50 in DU-145 and PC-3 and could be an interesting compound to be explored in prostate cancer. Co-treatment with docetaxel and NEK6 inhibitor significantly reduced colony formation and cell migration. Knockout of NEK6 in DU-145 and PC-3 cells sensitizes the cells to docetaxel treatment. Resveratrol was also able to inhibit the expression of NEK6 and HK2. It was observed that NEK6 regulates the expression of the glycolytic enzyme HK2, connecting NEK6 with metabolic pathways in CRPC. It is suggested that the NEK6- HK2 signaling axis may be a possible resveratrol regulation mechanism. Conclusion: NEK6 may be a strategic target in prostate cancer and NEK6 inhibitors should be explored, as well as their use in combination with chemotherapy drugs Ver menos