Resumo: Klebsiella pneumoniae é um importante patógeno para humanos, estando associado a diferentes tipos de infecções de difícil tratamento, uma vez que esta bactéria pode exibir o fenótipo de resistência múltipla a drogas (MDR), incluindo a resistência a antimicrobianos ?-lactâmicos e carbapenêmicos. A produção de vesículas da membrana externa (OMVs) é uma característica exibida por diferentes organismos, incluindo bactérias patogênicas e a importância biológica da produção de OMVs por parte de organismos procariotos é crescente. A transmissão de resistência entre bactérias gram-negativas pode ocorrer através de OMVs porque atuam como um sistema de secreção e liberação de genes de resistência a antibióticos, genes de virulência ou plasmídeos, permitindo a disseminação deles no ambiente e promovendo a interação com outras células sem contato celular. Considerando estas observações, o objetivo deste projeto foi caracterizar as OMVs produzidas por linhagens de Klebsiella spp. resistentes e suscetíveis a ?-lactâmicos quanto sua estrutura e ao conteúdo de ácidos nucleicos, e avaliar seu potencial para transferir genes codificadores de carbapenemases a outras bactérias. Entre os dados obtidos, K. pneumoniae ATCC BAA-2146 apresentou resistência a todos os antimicrobianos testados e a expressão de carbapenemase confirmada. K. quasipneumoniae ATCC 700603 mostrou resistência às cefalosporinas por expressar ESBL e K. pneumoniae ATCC 13883 apresentou suscetibilidade à maioria dos antimicrobianos, como esperado. Estes resultados foram confirmados por testes de perfil de resistência, testes fenotípicos para detecção de enzimas e PCR para detecção de genes de resistência. Além disso, a produção de OMVs pelas linhagens de Klebsiella spp.com diâmetros entre 30 nm e 500 nm, com predomínio de diâmetros menores que 200 nm, foi demostrada durante o crescimento in vitro na fase estacionária atingindo concentrações desde 8,37 x 1011 vesículas/ml a 1,36 x 1012 vesículas/ml. Quanto à caracterização estrutural, as análises por NTA e TEM confirmaram a aparência esférica e de membrana dupla das OMVs. As análises por PCR demostraram a presença do gene blaSHV nas OMVs produzidas pelas três linhagens avaliadas de Klebsiella spp. e a presença do gene blaNDM apenas em algumas OMVs de ATCC BAA-2146. Embora múltiplos experimentos de transferência de genes tenham sido realizados em diferentes condições, não foi possível obter transformantes Ver menos

Abstract: Klebsiella pneumoniae is an important pathogen for humans, frequently associated with different types of difficult-to-treat infections, since this bacterium usually exhibits a multidrug resistant phenotype (MDR), including resistance to ?-lactams and carbapenem antimicrobials. The production of outer membrane vesicles (OMVs) is a characteristic exhibited by different organisms including pathogenic bacteria and the biological importance of OMVs secreted by prokaryotic organisms is increasing. The transmission of resistance between gram-negative bacteria can occur through OMVs because they act as a secretion-delivery system for antibiotic resistance genes, virulence genes or plasmids, allowing their long-distance dissemination into the environment and promoting interaction with other cells without bacterial contact. Considering this information, the objective of this project is to characterize OMVs produced by Klebsiella spp. strains resistant and susceptible to ?-lactams in terms of structure and nucleic-acid contents, and evaluate their potential to transfer genes encoding resistance markers to other bacteria. Among the data obtained, K. pneumoniae ATCC BAA-2146 showed resistance to all tested antimicrobials and confirmed carbapenemase expression, K. quasipneumoniae ATCC 700603 showed resistance to cephalosporins (ESBL phenotype) and K. pneumoniae ATCC 13883 showed susceptibility to most of the antimicrobials as expected. These results were confirmed by resistance profile tests, phenotypic tests for enzyme detection and PCR for resistance gene detection. In addition, the production of OMVs by Klebsiella spp. strains with diameters between 30 nm and 500 nm with a predominance of diameters smaller than 200 nm, was demonstrated during in vitro growth in the stationary phase, reaching concentrations from 8,37 x 1011 vesicles/ml to 1,36 x 1012 vesicles/ml. Structural characterization by NTA and TEM analyzes confirmed the spherical and double membrane appearance of the OMVs. PCR analyzes showed the presence of blaSHV gene in the OMVs produced by the three strains evaluated of Klebsiella spp. and the presence of blaNDM gene only in some OMVs of ATCC BAA-2146. Although multiple gene transfer experiments were performed under different conditions, it was not possible to obtain transformants Ver menos