Resumo: Streptococcus sanguinis é uma espécie bacteriana comensal abundante da cavidade bucal, a qual é capaz de iniciar a colonização dos dentes por escapar da ação de anticorpos salivares S-IgA1 através da expressão de proteases de IgA1, e por produzir DNA extracelular (eDNA) e exopolissacarídeos (EPS) derivados da sacarose. Esta espécie é também comumente associada a infecções cardiovasculares oportunistas, o que sugere capacidade de escapar das funções de defesa da corrente sanguínea mediada pelo sistema complemento. O objetivo deste estudo foi investigar os papéis de eDNA, EPS derivados da sacarose e de IgA1-protease na capacidade de S. sanguinis de escapar do sistema complemento. Para isto, cepas mutantes knockout dos genes que codificam a protease de IgA1 (iga), a enzima piruvato oxidase requerida para a produção de eDNA (spxB) e a glicosiltranferase (gtfP) requerida para a síntese de EPS a partir da sacarose, foram obtidas a partir da cepa S. sanguinis SK36 (e respectivamente designadas SKiga, SKspxB e SKgtfP). As mutantes foram então comparadas com a cepa parental quanto à susceptibilidade à deposição de C3b e fagocitose por neutrófilos (PMN) isolados de sangue periférico humano, em ensaios de citometria de fluxo. Cinco cepas isoladas da cavidade bucal ou da corrente sanguínea foram também analisadas quanto à produção de eDNA e/ou EPS sob diferentes condições e quanto aos perfis de ligação à C3b. Os efeitos do tratamento bacteriano com DNAse I na deposição de C3b e na opsonofagocitose por PMN também foram analisadas em todas as cepas estudadas. A deleção de spxB e gtfP promoveu aumento significativo na deposição de C3b e na opsonofagocitose por PMN sob condições que promovem a produção de eDNA e de EPS, respectivamente (Kruskal Wallis seguido do teste de Dunn; p<0,05). A deposição de C3b e/ou opsonofagocitose por PMN também foram significativamente aumentadas nas cepas SK36 e SK160 que produziam maiores quantidades de eDNA após o tratamento com DNase I, comparadas às mesmas cepas não tratadas. Além disso, entre as cepas mais produtoras de EPS, o crescimento em meio livre de sacarose (para eliminar a síntese de EPS) promoveu maior deposição de C3b em comparação à mesma cepa cultivada na presença de sacarose (p<0,05). Não houve diferença estatisticamente significante na deposição de C3b ou na opsonofagocitose por PMN entre SKiga e SK36. Portanto, a produção de eDNA ou de EPS derivados da sacarose contribuem para o escape de S. sanguinis à imunidade mediada pelo sistema complemento, enquanto que a expressão de protease de IgA1 não afeta significativamente a susceptibilidade de SK36 ao sistema complemento Ver menos

Abstract: Streptococcus sanguinis is an abundant commensal bacterial species of the oral cavity capable of initiating biofilms on tooth surfaces by evading salivary S-IgA1 antibodies through the expression of IgA1 protease, and by producing extracellular DNA (eDNA), as well as exopolysaccharides (EPS) from sucrose. This species is also commonly associated with opportunistic cardiovascular infections, which might imply the capacity to evade blood clearance immune functions mediated by the complement system. The aim of this study was to investigate the roles of eDNA, sucrose-derived EPS and IgA1 protease in the capacity of S. sanguinis to evade the complement system. To this end, deletion mutants of genes encoding for the IgA1 protease (iga), pyruvate oxidase required for the production of eDNA (spxB), and glucosyltransferase P (gtfP) required for the synthesis of EPS from sucrose were obtained in the S. sanguinis strain SK36 (respectively named SKiga, SKspxB and SKgtfP). Mutants were then compared with parent strain regarding their susceptibility to C3b deposition and to phagocytosis by neutrophils (PMN) isolated from human peripheral blood, in flow cytometry assays. Five wild-type strains from the oral cavity or from the bloodstream were also analyzed regarding their production of eDNA and/or EPS at different conditions, as well as to their profiles of C3b binding. The effects of bacterial treatment with DNAse I in C3b binding and opsonophagocytosis was also assessed in all the studied strains. Deletion of spxB and gtfP promoted significant increases in C3b deposition and opsophagocytosis by PMN under conditions which promote production of eDNA and sucrose-derived EPS, respectively (Kruskal Wallis with post hoc Dunn’s test; p<0.05). In addition, C3b deposition and/or opsonophagocytosis by PMN were significantly increased in wild-type strains with high production of eDNA after treatment with DNase I, as compared to the same strain not treated with DNAse I. Moreover, strains producing sucrose-derived EPS showed increased C3b deposition when grown in the absence of sucrose (to avoid EPS synthesis), when compared to the same strain grown in the presence of sucrose (p<0.05). No significant difference in C3b deposition or in opsophagocytosis were found in SKigA as compared to SK36. These findings indicate that the production of eDNA and sucrose-derived EPS contribute to S. sanguinis evasion to complement-mediated immunity, whereas expression of IgA proteases does not significantly affect the capacity of SK36 to evade the complement system Ver menos