Resumo: Streptococcus sanguinis é uma espécie comensal abundante do microbioma bucal, a qual comumente causa infecções oportunistas cardiovasculares, incluíndo-se a endocardite infecciosa. Embora a sobrevivência de S. sanguinis na corrente sanguínea e nos tecidos extra-bucais seja necessária para que esta espécie cause estas infecções sistêmicas, os mecanismos de escape desta espécie à imunidade mediada pelo sistema complemento não são conhecidos. Análises in silico dos genomas de S. sanguinis revelaram a presença do gene cppA, o qual codifica uma proteína (CppA) anotada como protease degradadora de C3, componente efetor central do complemento. O objetivo deste estudo foi investigar a participação de CppA no escape de S. sanguinis à imunidade mediada pelo sistema complemento. Para isto, inicialmente a expressão de cppA foi investigada através de ensaios de RT-qPCR em nove cepas previamente caracterizadas de S. sanguinis, incluíndo-se SK36 e cepas clínicas isoladas da cavidade bucal e da corrente sanguínea. A seguir, foi construída por recombinação homóloga uma cepa mutante isogênica cppA a partir da cepa SK36 (nomeada SKcppA). SKcppA foi ainda transformada com um plasmídeo auto-replicativo contendo uma cópia de cppA, para gerar a cepa complementada SKcppA+, utilizada como controle. Ensaios de citometria de fluxo foram então realizados para comparar SK36, SKcppA, e SKcppA+ quanto à ligação a C3b, a proteínas ativadoras do complemento (C1q e SAP) e a proteínas inibidoras do complemento (Fator H e C4BP), após tratamento com soro humano (20%) ou com PBS e soro inativado (controles negativos). Comparações na frequência de fagocitose por neutrófilos (PMN) isolados de sangue periférico humano foram realizadas com as mesmas cepas previamente marcadas com fluoróforo (FITC) e expostas aos PMN em meio acrescido ou não de 20% de soro, sendo as proporções de PMN com bactérias intracelulares determinadas por citometria de fluxo. A sobrevivência das cepas em sangue humano foi também avaliada em ensaios ex vivo. As frequências de transformação natural com plasmídeo auto-replicativo também foi comparada. Aumento significativo na deposição de C3b foi observado em SKcppA em comparação com SK36 e SKcppA+ (Kruskal-Wallis, p<0,05). SKcppA também mostrou maior ligação a C1q e SAP, além de redução significativa na ligação a C4BP e FH. Consistentemente, SKcppA apresentou aumento significativo na opsonofagocitose por PMN (p <0,05) e redução significativa (da sobrevivência) ex vivo após 4 a 42 h de incubação em sangue humano, em comparação à SK36 e à SKcppA+ (Kruskal-Wallis, p<0,05). Moderado aumento na eficiência de transformação (20% relativo à SK36) foi observado em SKcppA (p <0,05). Os resultados deste estudo demonstram que CppA é uma proteína de escape à deposição de C3b e opsonofagocitose por PMN, interferindo na ligação bacteriana a C1q e SAP e recrutando proteínas inibidoras do complemento. CppA é ainda requerida para a sobrevivência de S. sanguinis em sangue humano, apresentando pequena influência no fenótipo de competência desta espécie. O papel importante de CppA nos fenótipos de S. sanguinis associadas à virulência reportados neste estudo suportam a utilização desta protease como alvo terapêutico para controle de infecções sistêmicas oportunistas por estreptococos Ver menos

Abstract: Streptococcus sanguinis is an abundant commensal species of the oral microbiome, which commonly causes opportunistic cardiovascular infections, including infective endocarditis. Although S. sanguinis survival in the bloodstream and in extra-oral tissues are required for its systemic virulence, the mechanisms involved in evasion of this species to complement-mediated immunity are unknown. In silico analysis of S. sanguinis genomes revealed the gene cppA, encoding for a protein (CppA) annotated as a degrading protease of C3, a central effector component of the complement. The aim of this study was to investigate the role of CppA in S.sanguinis evasion to complement-mediated immunity. To this end, cppA expression was initially assessed by RT-qPCR in nine previously characterized S. sanguinis strains, including SK36 and clinical strains isolated from the oral cavity or from the bloodstream. Then, a nonpolar isogenic mutant of cppA (called SKcppA) was constructed by homologous recombination in strain SK36. SKcppA was also transformed with a shuttle plasmid harboring a full copy of cppA to yield the complemented strain SKcppA+, used as control. Flow cytometry assays were then applied to compare SKcppA, SK36 and SKcppA+ regarding their binding to C3b, to the complement activating proteins C1q and SAP, and to complement down-regulators (fator H and C4BP), after treatment with human serum (20%) or with PBS or heat-inactivated serum (negative controls). The frequencies of bacterial phagocytosis by neutrophils (PMN) isolated from human peripheral blood were assessed in the same strains previously labeled with FITC fluorophore and exposed to PMN in medium supplemented or not with 20% human serum. Persistence of strains in human blood were also assessed in ex vivo assays. Additionally, the frequencies of natural transformation with a shuttle-plasmid were determined for strain comparisons. Significant increase in C3b deposition was observed in SKcppA as compared to SK36 and SKcppA+ (Kruskal-Wallis, p<0,05). SKcppA did also show increased binding to C1q and SAP, whereas significant reductions in binding to C4BP e FH. Consistently, SKcppA showed significant increases in opsonophagocytosis by PMN (p <0,05) and significant reductions in ex vivo survival in blood after 4 to 42 h of incubation, when compared to SK36 and SKcppA+ (Kruskal-Wallis, p<0,05). Slight increase in transformation efficiency (20% in relation to SK36) was observed in SKcppA (p <0,05). These findings show that CppA functions in evasion to C3b deposition and opsonophagocytosis by PMN, affecting bacterial binding to C1q and SAP, and recruiting complement down-regulator proteins. CppA is also required for S. sanguinis persistence in human blood and shows slight influence on S. sanguinis competence phenotype. The important role of CppA in virulence-associated functions in S. sanguinis here reported support the application of this protease as a therapeutic target for controlling systemic infections by oral streptococci Ver menos