Efeitos do Valproato de Sódio nos níveis de metilações da histona H3, na interação VPA-histonas e na regulação dos genes p16ink4a e p21waf1/cip1 em células HeLa [recurso eletrônico] = Effects of Sodium Valproate on histone H3 methylation levels, VPA-histones interaction and, regulation of p16ink4a and p21waf1/cip1 genes in HeLa cells
Marina Amorim Rocha
TESE
Multilíngua
T/UNICAMP R582e
[Effects of Sodium Valproate on histone H3 methylation levels, VPA-histones interaction and, regulation of p16ink4a and p21waf1/cip1 genes in HeLa cells]
Campinas, SP : [s.n.], 2022.
1 recurso online (107 p.) : il., digital, arquivo PDF.
Orientadores: Maria Luiza Silveira Mello, Benedicto de Campos Vidal
Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia
Resumo: Em eucariotos, o estado da cromatina, o empacotamento de DNA com proteínas histonicas, contribui para o controle da expressão gênica. Assim como outras modificações pós-tradução de histonas (PTMs), a metilação de histonas em resíduos de lisina contribui para a regulação de diversos processos...
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Resumo: Em eucariotos, o estado da cromatina, o empacotamento de DNA com proteínas histonicas, contribui para o controle da expressão gênica. Assim como outras modificações pós-tradução de histonas (PTMs), a metilação de histonas em resíduos de lisina contribui para a regulação de diversos processos biológicos. Famílias de proteínas, como por exemplo, as lisinas metiltransferases (KMTs) e demetilases (KDMs), são responsáveis por controlar os níveis de metilação nos resíduos de lisina da histona. Portanto, um equilíbrio adequado de estabilidade e dinâmica em PTMs de histonas é necessário para a expressão gênica precisa. Apesar disso, aberrações nas regiões regulatórias controladas pela metilação da lisina podem estar associados com o silenciamento de vários genes, incluindo os supressores de tumores, e são frequentemente observados no câncer. Por outro lado, é conhecido que inibidores de histona desacetilase (HDACi) podem induzir mudanças globais na modificação das histonas, podendo então reverter esse processo. O valproato de sódio (VPA), um conhecido agente antiepiléptico, é também caracterizado como HDACi, induzindo hiperacetilação de histonas e desmetilação de DNA em vários tipos de células. Em alguns modelos, também há dados mostrando que o VPA pode afetar a metilação das histonas bem como as enzimas que adicionam e removem essas marcas e pode regular a expressão de proteínas envolvidas no controle do ciclo celular. Dessa forma, neste estudo foi investigado por meio de técnicas de imunofluorescência, Western Blot e RT-qPCR a capacidade do VPA em alterar os níveis de metilações das histonas H3 (H3K4me2/3, H3K9me/2 e H3K27me/3) e das enzimas KMT2D, EZH2 e KDM3A em células HeLa, tratadas com VPA cujas concentrações foram de 0,5 mM e 2 mM por 24 h. Além disso, a expressão do oncogene p16INK4a e do gene supressor de tumor p21WAF1/Cip1 também foram analisados na presença dessa droga. Um estudo também foi conduzido a fim de avaliar a interferência do VPA em histonas totais, através da análise microespectroscópica das histonas totais no infravermelho por FT-IR ("Fourier transform-infrared"), uma vez que há evidencias recentes da afinidade do VPA ligando-se à histonas H1 e H3. Com base no conjunto de dados, os resultados sugerem que o VPA promoveu hipermetilação em marcas associadas à transcrição ativa de genes, H3K4me2/3 e H3K9me, e conferiu um estado hipometilado para a marca associada ao silenciamento, H3K9me2. Apesar de observar o aumento nos níveis globais de H3K27me/3, nenhuma conexão causal para essas marcas com a expressão gênica pode ser concluída até o momento, uma vez que elas foram identificadas na literatura com consequências regulatórias distintas. O VPA alterou os níveis dessas marcas epigenéticas possivelmente por participação das metiltransferases KMT2D, EZH2 e demetilase KDM3A. Nessas condições o VPA também induziu a ativação da proteína supressora de tumor p21WAF1/Cip1 e reprimiu a ação de p16INK4a nessas células. Além disso, esses resultados indicaram que o VPA possa promover parada na fase G1 do ciclo celular por indução de p21WAF1/Cip1. Quanto a análise da possível interação do VPA com as histonas, não foi observado nenhuma modificação conformacional dessas proteínas ao longo do espectro. No entanto, notou-se um ligeiro aumento na absorbância na região de frequência dos grupos CH3 e CH2 nos espectros de FT-IR, que pode ser justificado pela intensificação das metilações em alguns dos resíduos de lisina na histona H3. Até o momento foi possível notar que o VPA altera o epigenoma na linhagem celular tumoral estudada, por meio das alterações das metilações nos resíduos de lisina 4, 9 e 27 da histona H3. Entretanto, o VPA promoveu aumento em marcas associadas à transcrição ativa de genes e diminuiu aquelas relacionadas ao silenciamento, sendo consistentes com uma possível intensificação da expressão gênica global induzida por esta droga. Portanto, o VPA pode oferecer uma estratégia potencial para reverter mudanças epigenéticas, principalmente associadas a doenças como o câncer. No entanto, quanto à expressão dos genes p16INK4a e p21WAF1/Cip1 eles podem ser regulados em células HeLa por HDACi que atuam sobre marcas epigenéticas ao nível de DNA e histonas
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Abstract: In eukaryotes, the state of chromatin, the DNA packaging with histone proteins, contributes to the control of gene expression. Like other post-translational histone modifications (PTMs), histone methylation at lysine residues contributes to the regulation of several biological processes....
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Abstract: In eukaryotes, the state of chromatin, the DNA packaging with histone proteins, contributes to the control of gene expression. Like other post-translational histone modifications (PTMs), histone methylation at lysine residues contributes to the regulation of several biological processes. Protein families, such as lysine methyltransferases (KMTs) and demethylases (KDMs), are responsible for controlling methylation levels at histone lysine residues. Therefore, a proper balance of stability and dynamics in histone PTMs is necessary for accurate gene expression. Despite this, aberrations in regulatory regions controlled by lysine methylation may be associated with the silencing of several genes, including tumor suppressors, and are frequently observed in cancer. On the other hand, it is known that histone deacetylase inhibitor (HDACi) can induce global changes in histone modification, thus being able to reverse this process. Sodium valproate (VPA), a well-known antiepileptic agent, is also characterized as HDACi, inducing histone hyperacetylation and DNA demethylation in various cell types. In some models, there are also data showing that VPA can affect histone methylation as well as the enzymes that add and remove these tags, and can regulate the expression of proteins involved in cell cycle control. Thus, in this study, the ability of VPA to alter the methylation levels of histone H3 (H3K4me2/3, H3K9me/2 and H3K27me/3) and of the enzymes KMT2D, EZH2 and KDM3A was investigated using immunofluorescence, Western Blot and RT-qPCR techniques in HeLa cells, treated with VPA whose concentrations were 0.5 mM and 2 mM for 24 h. In addition, the expression of p16INK4a oncogene and p21WAF1/Cip1 tumor suppressor gene were also analyzed in the presence of this drug. A study was also carried out in order to evaluate the interference of VPA in total histones, through the microspectroscopic analysis of total histones in the infrared by FT-IR ("Fourier transform-infrared"), since there is recent evidence of the affinity of VPA binding up to histones H1 and H3. Based on the dataset, the results suggest that VPA promoted hypermethylation in markers associated with active gene transcription, H3K4me2/3 and H3K9me, and conferred a hypomethylated state on the marker associated with silencing, H3K9me2. Despite observing the increase in global levels of H3K27me/3, no causal connection for these marks with gene expression can be concluded to date, as they have been identified in the literature with distinct regulatory consequences. VPA altered the levels of these epigenetic marks possibly through the participation of methyltransferases KMT2D, EZH2 and demethylase KDM3A. Under these conditions, VPA also induced the activation of the tumor suppressor protein p21WAF1/Cip1 and repressed the action of p16INK4a in these cells. Furthermore, these results indicated that VPA can promote arrest in the G1 phase of the cell cycle by inducing p21WAF1/Cip1. Regarding the analysis of the possible interaction of VPA with histones, no conformational modification of these proteins was observed along the spectrum. However, a slight increase in absorbance was observed in the frequency region of the CH3 and CH2 groups in the FT-IR spectra, which can be explained by the intensification of methylations in some of the lysine residues in histone H3. So far, it has been possible to notice that VPA alters the epigenome in the studied tumor cell line, through alterations in methylations in lysine residues 4, 9 and 27 of histone H3. However, VPA promoted an increase in markers associated with active transcription of genes and decreased those related to silencing, being consistent with a possible enhancement of global gene expression induced by this drug. Therefore, VPA may offer a potential strategy to reverse epigenetic changes, mainly associated with diseases such as cancer. However, regarding the expression of p16INK4a and p21WAF1/Cip1 genes, they can be regulated in HeLa cells by HDACi that act on epigenetic marks at the DNA and histone levels
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Mello, Maria Luiza Silveira, 1943-
Orientador
Vidal, Benedicto de Campos, 1930-
Coorientador
Vicente, Cristina Pontes, 1965-
Avaliador
Bruschi, Daniel Pacheco, 1987-
Avaliador
Pimentel, Edson Rosa, 1949-
Avaliador
Efeitos do Valproato de Sódio nos níveis de metilações da histona H3, na interação VPA-histonas e na regulação dos genes p16ink4a e p21waf1/cip1 em células HeLa [recurso eletrônico] = Effects of Sodium Valproate on histone H3 methylation levels, VPA-histones interaction and, regulation of p16ink4a and p21waf1/cip1 genes in HeLa cells
Marina Amorim Rocha
Efeitos do Valproato de Sódio nos níveis de metilações da histona H3, na interação VPA-histonas e na regulação dos genes p16ink4a e p21waf1/cip1 em células HeLa [recurso eletrônico] = Effects of Sodium Valproate on histone H3 methylation levels, VPA-histones interaction and, regulation of p16ink4a and p21waf1/cip1 genes in HeLa cells
Marina Amorim Rocha