Resumo: As atuais tecnologias de produção de etanol combustível de segunda geração (2G), com base em matérias-primas lignocelulósicas, enfrentam sérias dificuldades para se tornarem economicamente viáveis, tendo até agora alcançado volumes de produção bem abaixo das previsões feitas há uma ou duas décadas. Como iniciativa para enfrentar alguns dos desafios inerentes a esses processos industriais, aqui propomos um conceito alternativo, baseado na integração de tecnologias de primeira geração (1G) e 2G, no contexto de biorrefinarias de cana-de-açúcar. O conceito envolve uma mistura da corrente rica em sacarose do processo 1G com uma corrente 2G parcialmente hidrolisada, rica em celobiose, na etapa de fermentação. A estratégia também envolve o que chamamos de plataforma microbiana "iSUCCELL", responsável por realizar a fermentação da sacarose e da celobiose em etanol, via transporte ativo dos açúcares e suas subsequentes hidrólises intracelulares. Primeiramente, abordamos separadamente o metabolismo de cada dissacarídeo na levedura Saccharomyces cerevisiae. O componente "iCELL" foi estudado através da engenharia de linhagens de S. cerevisiae com o transportador de celobiose CDT-1 de Neurospora crassa e seis ?-glicosidases individuais de diferentes fungos filamentosos: uma de N. crassa (GH1-1), uma de Aspergillus niger (AN 8517) e quatro de Podospora anserina (PA 951, PA 3784, PA 6071 e PA 10293), sendo as cinco últimas enzimas ainda até então não descritas na literatura. Uma vez que nenhuma das linhagens engenheiradas inicialmente foi capaz de crescer em celobiose, uma posterior abordagem de evolução laboratorial foi conduzida para melhorar o desempenho cinético de todas as linhagens. Após a conclusão dos experimentos de evolução, embora a cinética de crescimento de todas as linhagens em celobiose como única fonte de carbono tenha melhorado, a análise dos dados de sequenciamento genômico revelou que pelo menos dois dos experimentos de evolução foram contaminados com Meyerozyma guilliermondii, uma espécie de levedura que conseguiu se estabelecer no sistema de cultivo, provavelmente devido à sua capacidade natural de utilizar a celobiose como fonte de carbono. Para o componente "iSUC" de nossa estratégia, lançamos mão das propriedades de uma linhagem iSUC de S. cerevisiae obtida em um trabalho anterior (Basso et al. 2011) e que apresenta maior rendimento em etanol, frente a uma linhagem referência. Avaliamos seu desempenho em situações mais condizentes com o cenário industrial, ou seja, em sistema de cultivo em batelada, com excesso de açúcar, e em um sistema miniaturizado que mimetiza o processo brasileiro de produção de etanol combustível 1G. Os resultados desses estudos mostraram que a linhagem iSUC não foi capaz de apresentar incremento no rendimento em etanol, quando comparada à linhagem referência que hidrolisa a sacarose predominantemente no meio extracelular. Analisados em conjunto, os resultados apresentados nesta tese, embora não tenham conduzido ao nosso objetivo inicial, abrem as portas para estudos futuros que visem demonstrar o potencial da abordagem iSUCCELL em uma linhagem industrial robusta e em um ambiente industrial real Ver menos

Abstract: Current second-generation (2G) fuel ethanol technologies are facing severe difficulties to become economically viable, having so far reached production volumes well below predictions made one or two decades ago. As an initiative to tackle some of the challenges inherent to these processes, here we propose an alternative concept that relies on the integration of first-generation (1G) and 2G sugarcane-based processes by mixing the sucrose-rich stream from the 1G process with a partially hydrolysed cellobiose-rich 2G stream in the fermentation step. The strategy also involves what we named a microbial "iSUCCELL" platform, responsible for carrying out fermentation of sucrose and cellobiose into ethanol, via active transport of the sugars and their subsequent intracellular hydrolyses. We first addressed the metabolism of each disaccharide in the yeast Saccharomyces cerevisiae, separately. The "iCELL" component was studied by engineering S. cerevisiae strains with the Neurospora crassa CDT-1 cellobiose transporter and six individual ?-glucosidases from different filamentous fungi: one from N. crassa (GH1-1), one from Aspergillus niger (AN 8517), and four from Podospora anserina (PA 951, PA 3784, PA 6071, and PA 10293), the latter five being hitherto undescribed enzymes. Since none of the engineered strains initially sustained growth on cellobiose, a further laboratory evolution approach was applied to improve the kinetic performances of all strains. After completion of the evolution experiments, although the growth kinetics of all strains on cellobiose as a sole carbon source indeed improved, analysis of whole-genome sequencing data revealed that at least two of the evolution experiments had been contaminated with Meyerozyma guilliermondii, a yeast species that managed to settle in the cell population, probably because of its natural capacity to utilise cellobiose as carbon source. For the "iSUC" component of our strategy, we leveraged the properties of a S. cerevisiae iSUC strain obtained in a previous work (Basso et al. 2011), in terms of increased ethanol yields vs. a reference strain, and evaluated its performance in situations which are closer to the industrial scenario, i.e., in batch operation with excess sugar and in a miniaturised system mimicking the Brazilian 1G fuel ethanol process. The results from these studies showed that the iSUC strain was not able to display any increment in the ethanol yield on substrate, when compared to the reference strain that mainly hydrolysed sucrose extracellularly. Analysed together, the results presented in this thesis, although not leading to reach our initial goal, open the door for future studies aiming at demonstrating the potential of the iSUCCELL approach in a robust industrial strain and in a real industrial environment Ver menos