Resumo: A demanda por vacinas e medicamentos para o combate de doenças impulsiona a busca por novas tecnologias na área de nanobiotecnologia, como é o caso recente da corrida para a vacina da COVID-19. Nesse sentido, a terapia e vacinação gênicas emergem como potenciais ferramentas de combate. No entanto, um dos maiores obstáculos para o sucesso desta técnica consiste em entregar eficientemente o material genético (DNA/RNA) nas células-alvo. Para contornar esse problema, nanocarreadores não virais podem ser explorados. Dentre eles, lipossomas catiônicos e nanopartículas lipídicas se destacam como potenciais veículos de sistema de entrega de fármacos. A produção dessas nanoestruturas em sistemas microfluídicos operando em regime laminar permite se obter um melhor controle da mistura e das variáveis do processo, em comparação com os métodos convencionais bulk de produção. Porém, sistemas microfluídicos à base de difusão possuem baixa produtividade. Com o intuito de explorar o aumento de produtividade, a advecção caótica pode ser empregada, mas ainda requer compreensão do processo de formação destas nanoestruturas. Para auxiliar na compreensão da fluidodinâmica e do processo de mistura nos canais microfluídicos, simulações computacionais podem ser desenvolvidas, como o estudo de fluidodinâmica computacional (CFD). Nesse contexto, nosso grupo de pesquisa realizou o estudo de CFD e investigou a síntese de lipossomas em dispositivo microfluídico 3D de alta vazão (HFR-MD). No entanto, não foi analisada a potencial aplicação deste dispositivo na síntese de lipoplexos e nanopartículas lipídicas (LNPs). Baseado nisso, este projeto visa a incorporação de material genético (pDNA) em sistemas lipídicos (lipoplexos e LNPs) através do estudo de CFD e aplicação de técnica microfluídica de advecção caótica no dispositivo HFR-MD, visando contribuições na área da medicina. Para tal, investigou-se a melhor configuração de malha que pudesse fornecer a simulação computacional mais precisa. Dessa maneira, a análise de CFD permitiu antever o padrão de mistura e as condições de advecção caótica nas diferentes vazões testadas, que posteriormente serviu de apoio para a otimização das melhores condições de processo para a síntese das nanoestruturas. Foi observado que para a síntese de lipossomas catiônicos e stealth, apesar da advecção caótica melhorar as propriedades de diâmetro hidrodinâmico médio (tamanho) e polidispersão (PDI) das nanoestruturas, ela não se mostrou fundamental, pois a incorporação do lipídio PEGlado foi possível mesmo sem advecção caótica. Além disso, investigação entre o uso de água pura e tampão PBS na fase aquosa mostrou que a água pura foi mais eficaz na síntese adequada de lipossomas. Já para lipoplexos e LNPs, a advecção caótica em alta vazão se mostrou fundamental para evitar a formação de microagregados no canal e fornecer propriedades físico-químicas ótimas para aplicações. Além disso, a presença de uma barreira difusiva mostrou ser benéfica na formação de complexos pDNA/lipídios. Estudos de morfologia apontaram estruturas majoritariamente unilamelares para os lipossomas e lipoplexos stealth, estruturas mistas para lipoplexos catiônicos e possível núcleo denso de elétrons para LNPs. Por fim, teste in vitro realizado em colaboração com o Instituto de Ciências Biomédicas da USP apontou maior eficiência de transfecção para as LNPs, o que condiz com a literatura, porém sem relatar diferenças estatísticas com os lipoplexos. Como contribuição deste trabalho, a validação do dispositivo HFR-MD na síntese de nanoestruturas complexas em condições de alta produtividade infere seu potencial uso para futuras investigações de LNPs com lipídios ionizáveis de última geração, bem como aplicações in vivo visando a produção de vacinas gênicas e aumento de escala Ver menos

Abstract: The demand for vaccines and medicines to fight diseases drives the search for new technologies in nanobiotechnology, as it is the recent case of the race for the immunization of COVID-19. In this sense, gene therapy and vaccination emerge as potential combat tools. However, one of the greatest obstacles to this technique's success lies in efficiently delivering the genetic material (DNA/RNA) to the target cells. To overcome this problem, non-viral nanocarrier vehicles can be explored. Cationic liposomes and lipid nanoparticles stand out as potential vehicles for drug delivery systems. The production of these nanostructures in microfluidic systems operating in a laminar flow enables better control over the mixture and over the process variables compared to the conventional bulk production methods. However, diffusion-based microfluidic systems have low productivity. To explore the increase in productivity, the chaotic advection can be employed, but it still requires a comprehension of the formation process of these nanostructures. To help the fluid dynamics and the mixing process comprehension in microfluidic channels, computational simulations can be developed, such as the study of computational fluid dynamics (CFD). In this context, our research group carried out the CFD study and investigated the synthesis of liposomes in a high flow rate 3D microfluidic device (HFR-MD). However, the potential application of this device in the synthesis of lipoplexes and lipid nanoparticles (LNPs) was not analyzed. Based on that, this project aims to incorporate genetic material (pDNA) into lipid systems (lipoplexes and LNPs) by CFD study and application of chaotic advection microfluidic technique in HFR-MD, aiming contributions in the field of medicine. For this, the best mesh configuration that could provide the most accurate computational simulation was investigated. In this way, the CFD analysis allowed the prediction of the mixing pattern and the chaotic advection conditions in the different flow rates tested, which later served as support for optimization of the best process conditions to synthesize nanostructures. It was observed that for the synthesis of cationic and stealth liposomes, despite the chaotic advection improvements in the hydrodynamic mean diameter (size) and polydispersity (PDI) properties of the nanostructures, it was not fundamental, since the incorporation of the PEGlated lipid was possible even without chaotic advection. Furthermore, investigation between the use of pure water and PBS buffer in the aqueous phase showed that pure water was more effective in the proper synthesis of liposomes. For lipoplexes and LNPs, high flow chaotic advection proved to be fundamental to avoid the formation of microaggregates in the channel and provide optimal physicochemical properties for applications. Furthermore, the presence of a diffusive barrier was shown to be beneficial in the formation of pDNA/lipid complexes. Morphology studies showed mostly unilamellar structures for liposomes and stealth lipoplexes, mixed structures for cationic lipoplexes and possible electron dense core for LNPs. Finally, in vitro test carried out in collaboration with Instituto de Ciências Biomédicas of USP showed greater transfection efficiency for LNPs, which is consistent with literature, however, without reporting statistical differences with lipoplexes. As a contribution of this work, the validation of HFR-MD for the synthesis of complex nanostructures under high throughput conditions infers its potential use for future investigations of LNPs with ionizable lipids, as well as in vivo applications aiming the production of gene vaccines and scale-up Ver menos