Resumo: Streptococcus sanguinis é uma espécie comensal comum em biofilmes dentários, capaz de inibir a colonização por espécies cariogênicas e de liberar DNA genômico extracelular (DNAe) para formar biofilmes. O gene ssa_0094 de S. Sanguinis codifica uma hidrolase de mureína e é regulado pelo sistema de dois componentes VicRK. Este estudo investigou a função do gene ssa_0094 na produção de DNAe e na formação de biofilmes por S. sanguinis. Para isto, ssa_0094 foi inativado na cepa de S. sanguinis SK36 por recombinação homóloga com um alelo nulo, para produzir a mutante isogênica SK0094. SK0094 foi complementada com uma cópia epissomal de ssa_0094 gerando a cepa SK0094+. SK0094 foi comparada com SK36 e SK0094+ em análises de curvas de crescimento em BHI, produção de DNAe e formação de biofilme. Quantidades de DNAe foram quantificadas em sobrenadantes de culturas planctônicas através de qPCR com primers para o gene 16SrRNA. Biofilmes foram obtidos em microplacas de poliestireno durante 18h de incubação em diferentes meios de cultura. Análises de quantificação de DNAe em culturas planctônicas mostraram que a inativação do gene ssa_0094 promove maior liberação de DNAe no mutante SK0094 comparado com a cepa SK36 (p<0.05), enquanto a cepa complementada SK0094+ tem a produção de DNAe semelhante à SK36. Entretanto, a inativação de ssa_0094 promoveu pequena redução, mas significativa, na formação de biofilmes em meio BHI com sacarose suplementado ou não com saliva humana durante 18h de incubação (p<0.05). Os dados obtidos revelam que a inativação de ssa_0094 promove maior produção de DNAe, mas compromete a maturação de biofilmes por S. sanguinis. Assim estudos funcionais da proteína ssa_0094 poderão fornecer informações importantes sobre o papel do DNAe e da homeostase da parede celular na formação e maturação de biofilmes por S. sanguinis Ver menos

Abstract: Streptococcus sanguinis is a common commensal specie on dental biofilms, capable of inhibiting colonization by cariogenic species, in addition to releasing extracellular genomic DNA (eDNA) to form biofilms. The gene ssa_0094 encodes for a murein hydrolase of S. sanguinis and is regulated by the VicRK two-component system. This study investigates functions of ssa_0094 in the production of eDNA and biofilm formation in S. sanguinis. To that purpose, ssa_0094 was inactivated in S. sanguinis strain SK36 by double cross-over recombination with a null allele, to yield SK0094 isogenic mutant. A complemented mutant harboring an episomal copy of ssa_0094 was also obtained (SK0094+). SK0094 was compared to SK36 and SK0094+ in analyses of growth curves in BHI, production of eDNA and biofilm formation. Amounts of eDNA were quantified in culture supernatants of planktonic cultures by qPCR with primers for 16SrRNA gene. Biofilms were obtained in polystyrene microwell plates during 18h of growth in different media. The isogenic ssa_0094 mutant showed increased production of eDNA compared to SK36 (p<0.05), whereas production of eDNA by the complemented mutant was similar to that observed for SK36. On the other hand, the ssa_0094 mutant showed slight, although statistically significant, reduction in biofilm formation during 18h of growth (p<0.05). These results show that deletion of ssa_0094 promotes increased production of DNAe, but compromises biofilm maturation in S. sanguinis SK36. These findings indicate that functional studies of ssa_0094 protein may provide important information about the roles of DNAe production and cell wall homeostasis in biofilm formation and maturation in S. sanguinis Ver menos