Resumo: O gene Dact1 é um importante membro de uma família gênica que codifica proteínas multifuncionais, as quais desempenham papéis no desenvolvimento embrionário e no adulto. Sua função mais conhecida é de modulador da via de sinalização Wnt/beta-catenina, que participa de múltiplos processos biológicos. Neste contexto, esta tese visou caracterizar a expressão gênica e proteica de Dact1 durante a miogênese esquelética de mioblastos murinos (C2C12) e também investigar in silico a modulação de Dact1 em miopatias no humano. Nossos achados revelaram ampla expressão gênica e proteica de Dact1 durante a miogênese em células C2C12, sugerindo que esta molécula possa atuar como um modulador bivalente da via Wnt/beta-catenina. Também foi demonstrado que a transcrição de Dact1 é modificada em doenças humanas, como as distrofias, o que prevê um possível papel fisiopatológico de Dact1 em doenças musculares. Esta tese também buscou ampliar a compreensão da regulação transcricional de Dact1, identificando e caracterizando CNEs (Conserved Non-coding Elements), que potencialmente atuam como elementos cis-reguladores deste gene. Análises de genômica comparativa revelaram a presença de oito CNEs no intervalo genômico KIAA0586-Dact1-Daam1 conservados entre humano, camundongo e galinha. Seis destes CNEs correspondem a elementos reguladores do Ensembl Regulatory Build no genoma humano. A análise de dados de atividade e repressão destes elementos no Ensembl permitiu verificar que há uma correlação entre os padrões de expressão de Dact1 no ser humano com os perfis de atividade/repressão destes elementos em diferentes contextos. A maioria destes CNEs apresenta sítios de ligação para fatores de transcrição (TFBSs) conservados evolutivamente, os quais geram redes de interação proteína-proteína de alta significância, possibilitando mapear interações físicas e/ou funcionais entre estas proteínas e associá-las à atividade de Dact1 em diversos contextos celulares e patológicos no humano. Esta análise sistemática apontou para o CNE4 como possível enhancer de Dact1 no contexto miogênico. A interação entre o CNE4 e o promotor de Dact1 foi confirmada por dados de Hi-C em músculo humano, disponíveis no Gene Expression Omnibus (GEO). Em adição, a atividade de enhancer do CNE4 foi validada in vitro por ensaio com o gene repórter Luciferase em células C2C12. O detalhamento da conservação evolutiva do CNE4 foi realizado comparando a sequência humana com aquelas correspondentes em organismos-modelo, animais domésticos e também de interesse econômico. A análise de TFBSs e de interação proteína-proteína do CNE4 para primatas e bovídeos revelou que as redes de fatores de transcrição geradas possivelmente regulam atividades distintas de Dact1 nestes grupos, indicando divergência funcional. Em conjunto, os resultados apresentados nesta tese abrem novos caminhos para investigações futuras sobre a função de Dact1 na miogênese esquelética e miopatias humanas, bem como apresenta um panorama inédito sobre a regulação transcricional de Dact1 em diferentes contextos, abrindo perspectivas para estudos funcionais e avaliação de SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) nestes elementos cis-reguladores que estejam associados a doenças ou processos evolutivos Ver menos

Abstract: Dact1 is an important member of a gene family that encodes multifunctional proteins, which play roles in embryonic and adult development. Dact1 is well known as modulator of Wnt/beta-catenin signaling pathway, which participates in multiple biological processes. In this context, this thesis aimed to characterize Dact1 gene and protein expression during the skeletal myogenesis of murine myoblasts (C2C12) and also to investigate in silico Dact1 modulation in human myopathies. Our findings revealed wide Dact1 gene and protein expression during myogenesis in C2C12 cells, suggesting that this molecule may act as a bivalent modulator of Wnt/beta-catenin pathway. It has also been shown that Dact1 transcription is modified in human diseases, such as dystrophies, which predicts a possible pathophysiological role of Dact1 in muscle diseases. This thesis also sought to broaden the understanding of the transcriptional regulation of Dact1, by identifying and characterizing CNEs (Conserved Non-coding Elements), which potentially act as cis-regulatory elements of this gene. Comparative genomic analyzes revealed the existence of eight CNEs in the KIAA0586-Dact1-Daam1 genomic range conserved between human, mouse, and chicken. Six of these CNEs correspond to regulatory elements of the Ensembl Regulatory Build in human genome. The analysis of activity and repression data of these elements in Ensembl allowed us to verify that there is a correlation between Dact1 expression patterns in humans and the activity/repression profiles of these elements in different contexts. Most of these CNEs have transcription factors binding sites (TFBSs) evolutionarily conserved, which generate protein-protein interaction networks with high significance, making it possible to map physical and/or functional interactions between these proteins and associate them with Dact1 activity in several cellular and pathological contexts in human. This systematic analysis pointed to CNE4 as a possible Dact1 enhancer in the myogenic context. The interaction between CNE4 and Dact1 promoter was confirmed by Hi-C data in human muscle, available on Gene Expression Omnibus (GEO). In addition, CNE4's enhancer activity was validated in vitro by Luciferase reporter gene assay on C2C12 cells. Further investigation on the evolutionary conservation of CNE4 were carried out by comparing the human sequence with those corresponding to model organisms, domestic animals and also those with economic interest. The TFBSs and CNE4 protein-protein interaction analysis of primates and bovines revealed that the transcription factors networks obtained possibly regulate distinct Dact1 activities within these groups, indicating functional divergence. Taken together, the results presented in this thesis open new perspectives for future investigations on Dact1 role in skeletal myogenesis and human myopathies, as well as shed a light on unprecedented scenario of Dact1 transcriptional regulation in different contexts, opening possibilities for functional assays and SNPs evaluation (Single Nucleotide Polymorphisms) in these cis-regulatory elements that can be associated with diseases or evolutionary processes Ver menos