Resumo: Miosinas são proteínas motoras com atividade ATPásica e apresentam processividade em filamentos de actina. A classe V das miosinas apresenta três genes parálogos em humanos, MYO5A, MYO5B e MYO5C, que codificam para as proteínas diméricas MyoVa, MyoVb e MyoVc. Essas proteínas motoras são responsáveis pelo transporte vetorial de vesículas, organelas, ácidos nucléicos e proteínas, fundamentais para exocitose, reciclagem de membranas e polarização celular, processos que estão intimamente relacionados com a pigmentação da pele, plasticidade sináptica e diferenciação celular. A maioria dos carregamentos transportados por MyoVs se ligam ao seu domínio cauda globular, localizado na região C-terminal da proteína, por meio de uma ou mais proteínas adaptadoras. Além disso, o domínio cauda globular contém um sítio de fosforilação cuja função ainda não é bem descrita. Evidências indicam que este evento possa atuar tanto como mais um nível de regulação da MyoVa para a escolha de carregamentos, ou também para indicar o momento em que a liberação desses carregamentos deve ser realizada. Neste sentido, por meio da técnica de duplo hibrido em levedura, buscamos expandir no conhecimento do interactoma da MyoVa principalmente relacionado ao evento de fosforilação. A partir do uso de um duplo mutante fosfo-mimético foi identificado quatro novos possíveis parceiros moleculares: Spermine Synthase; Tandem C2 Nuclear Protein; WD Repeat-Containing Protein 48; e Cold Shock Domain-Containing Protein E1. Duas das interações – Spermine Synthase (que teve sua interação confirmada in vitro) e Tandem C2 Nuclear Protein – foram estudadas por imunocitoquímica; e essas proteínas apresentaram um padrão pontual e discreto de colocalização com a MyoVa no citoplasma, e alterações fenotípicas quando o gene MYO5A foi silenciado por siRNA. Inesperadamente nenhuma das proteínas identificadas, validadas e curadas pelo método de duplo hibrido em levedura mostrou uma preferência de interação pela forma fosfo-mimética in vitro, o que não permitiu avançar no melhor entendimento da função dessa fosforilação. Paralelamente, outra interação inédita entre a MyoVc e a Rab3A foi alvo de estudos biofísicos e celulares, que se originou da parceria do nosso grupo de pesquisa com o Prof. Fukuda da Universidade Tohoku, sugerindo um potencial novo papel biológico para a MyoVc que é ainda pouco estudada em comparação com à MyoVa Ver menos

Abstract: Myosins are motor proteins with ATPase activity and processivity in actin filaments. The Myosin Class V presents, in humans, three paralogous genes, MYO5A, MYO5B and MYO5C, which encode the dimeric proteins MyoVa, MyoVb and MyoVc, respectively. These motor proteins are responsible for the transport of vesicles, organelles, nucleic acids and proteins, which is fundamental for exocytosis, membrane recycling and cell polarization; processes that are closely related to skin pigmentation, synaptic plasticity and cellular differentiation. Most of the cargoes transported by MyoVs bind to their globular tail domain, located at the C-terminal region of the protein, usually in the presence of one or more adaptor proteins. Moreover, the globular tail domain contains a phosphorylation site whose function is not yet well described. Evidence indicates that it may act as a further level of MyoVa regulation for the choice of cargoes, or also to indicate when MyoVa should release these cargoes. In this context, through the yeast two-hybrid technique, we sought to expand on the knowledge of the MyoVa interactome mainly related to the phosphorylation event. From the use of a double mutant phospho-mimetic was identified four new putative molecular partners: Spermine Synthase; Tandem C2 Nuclear Protein; WD Repeat-Containing Protein 48; and Cold Shock Domain-Containing Protein E1. Two of these interactions - Spermine Synthase (which had its interaction confirmed in vitro) and Tandem C2 Nuclear Protein - were studied by immunocytochemistry; and these proteins showed a punctual and discrete pattern of colocalization with MyoVa in the cytoplasm, and phenotypic changes were observed when the MYO5A gene was silenced by siRNA. Unexpectedly none of the proteins identified, validated and cured by the yeast two-hybrid method showed a preference for interaction by the phospho-mimetic form in vitro, which did not allow to advance in the better understanding of the role of phosphorylation. In parallel, another novel interaction between MyoVc and Rab3A was the subject of biophysical and cellular studies, which originated from the cooperation of our research group with Prof. Fukuda from Tohoku University, suggesting a potential new biological role for MyoVc that is still poorly studied compared to MyoVa Ver menos