Resumo: A leishmaniose é uma doença parasitária com ampla distribuição geográfica em áreas tropicais e subtropicais, incluindo o Brasil. Não há vacinas disponíveis para o controle da doença e a quimioterapia é restrita a algumas drogas tóxicas como os antimoniais pentavalentes e a anfotericina B. Embora não aprovada para o tratamento da leishmaniose no Brasil, a paromomicina tem sido usada no tratamento de leishmaniose visceral no Sul da Ásia, apresentando boa eficácia clínica. Estudos em outros organismos, demonstraram que as proteínas da subfamília ABC-F (ATP Binding Cassete) afetam a suscetibilidade à paromomicina, como por exemplo, o fator de alongamento 3 (EF-3) envolvido no processo de tradução de Saccharomyces cerevisiae. A busca de homólogos destas proteínas nas bases de dados do genoma de Leishmania (Leishmania) amazonensis identificou três genes no genoma desta espécie: ABCF1 (LAMA_000042000.1), ABCF2 (LAMA_000297600.1) e ABCF3 (LAMA_000698500.1), assim como em outras espécies de Leishmania. Neste trabalho, foi investigado o possível envolvimento destas proteínas na suscetibilidade e resistência à paromomicina, utilizando técnicas de genética molecular como superexpressão e inativação gênica dos genes que codificam as proteínas ABCF de L. (L.) amazonensis. Uma vez selecionadas as respectivas linhagens transgênicas, estas foram analisadas quanto ao fenótipo de crescimento e foram testadas quanto a suscetibilidade à paromomicina in vitro nas formas promastigotas. Verificou-se que as formas promastigotas das linhagens transgênicas não tiveram seu crescimento in vitro alterado de forma significativa em relação à linhagem selvagem. No caso das linhagens superexpressororas dos genes ABCFs, apenas a linhagem superexpressora do gene ABCF1 apresentou um valor de EC50 de cerca de 1,7 vezes maior que a linhagem selvagem, indicando que a superexpressão deste gene confere resistência à paromomicina. Foram geradas ainda linhagens knockout para os genes ABCFs. No entanto, foi possível apenas gerar mutantes nulos para o gene ABCF2 em L. (L.) amazonensis, indicando que os genes ABCF1 e ABCF3 são essenciais para o parasito no estágio promastigota. Os mutantes nulos para o gene ABCF2 apresentaram um valor de EC50 que correspondia à metade do valor de EC50 da linhagem selvagem, sugerindo um possível envolvimento na suscetibilidade à paromomicina medidada pela proteína ABCF2. Os resultados obtidos neste estudo contribuem para uma melhor compreensão do papel das proteínas ABCFs na resistência e suscetibilidade à paromomicina, além do possível envolvimento na biologia do parasito, como a infectividade in vitro em Leishmania Ver menos

Abstract: Leishmaniasis is a parasitic disease with wide geographical distribution in tropical and subtropical areas, including Brazil. There are no vaccines available to control the disease and chemotherapy is restricted to some toxic drugs such as pentavalent antimonials and amphotericin B. Although not approved for the treatment of leishmaniasis in Brazil, paromomycin has been used in the treatment of visceral leishmaniasis in the South from Asia, with good clinical efficacy. Studies in other organisms have shown that the proteins of the subfamily ABC-F (ATP Binding Cassette) affect the susceptibility to paromomycin, such as, for example, the elongation factor 3 (EF-3) involved in the translation process of Saccharomyces cerevisiae. The search for homologues of these proteins in the databases of the Leishmania (Leishmania) amazonensis genome identified three genes in the genome this species: ABCF1 (LAMA_000042000.1), ABCF2 (LAMA_000297600.1) and ABCF3 (LAMA_000698500.1), as well as in other Leishmania species. In this work, the possible involvement of these proteins in susceptibility and resistance to paromomycin was investigated, using molecular genetic techniques such as overexpression and gene inactivation of ABCFs genes of L. (L.) amazonensis. Once the respective transgenic lines were selected, they were analyzed for growth phenotype and tested for susceptibility to paromomycin in vitro in promastigote forms. It was found that the promastigote forms of the transgenic lines did not have their in vitro growth altered significantly in relation to the wild-type. In the case of the overexpressing lines of the ABCFs genes, only the overexpressing line of the ABCF1 gene showed an EC50 value of about 1.7 times greater than the wild-type, indicating that overexpression of this gene confers resistance to paromomycin. Knockout lines were also generated for the ABCFs genes. However, it was only possible to generate null mutants for the ABCF2 gene in L. (L.) amazonensis, indicating that the ABCF1 and ABCF3 genes are essential for the parasite in the promastigote stage. The null mutants for the ABCF2 gene showed an EC50 value that corresponded to half the EC50 value of the wild-type strain, suggesting a possible involvement in the susceptibility to paromomycin due to the ABCF2 protein. The results obtained in this study contribute to a better understanding of the role of ABCFs proteins in resistance and susceptibility to paromomycin, and the possible involvement in the biology of the parasite, such as in vitro infectivity in Leishmania Ver menos