Resumo:
Células neoplásicas compartilham características adquiridas durante o desenvolvimento tumoral essenciais para a progressão do câncer. Particularmente, a reprogramação do metabolismo tumoral é de suma importância para suprir a alta demanda energética e biossintética dessas células. As enzimas glutaminases (GLS) são peça-chave nesse processo. As GLS convertem a glutamina (GLN) em glutamato, que por sua vez, serve de substrato para formação de alfa cetoglutarato, um intermediário do ciclo do Ácido Tricarboxílico (TCA). Assim, a GLN é usada como uma fonte anaplerótica de precursores metabólicos do TCA, permitindo a síntese acelerada de biomoléculas e ganho de agressividade tumoral. Dois genes (GLS e GLS2) expressam quatro isoformas de GLS. Neste trabalho estudamos as variantes de GLS, KGA e GAC, devido a sua importância na progressão de diversos tipos de cânceres. Essas isoformas apresentam estrutura molecular divididas em 3 domínios: domínio glutaminolítico central, domínio N-terminal e C-terminal. No domínio C-terminal da isoforma KGA são encontradas sequências de interação proteína-proteína do tipo ankirin repeats (ANK) e sequências do tipo LXXLL (nuclear receptor box, NRbox), normalmente encontradas em reguladores de fatores de transcrição do tipo receptores nucleares. O domínio C-terminal de GAC, em contrapartida, é menor e desestruturado. Tal estrutura molecular nos leva a crer que as isoformas de GLS interajam com outras proteínas e participem de vias bioquímicas distintas do metabolismo de GLN e potencialmente importantes para o fenótipo tumoral. Estudos de duplo-híbrido em levedura realizados previamente no laboratório identificaram a enzima glicolítica piruvato kinase M2 (PKM2) como um potencial parceiro destas isoformas. Assim, o objetivo deste trabalho foi o de explorar a interação de GAC/KGA com PKM2 e aprofundar na descrição bioquímica dos achados, bem como em linhagens celulares de câncer de mama triplo negativo. Expressamos PKM2 em sistema heterólogo, a purificamos e mostramos por anisotropia de fluorescência que a mesma interage diretamente com GAC com maior afinidade do que com KGA. A formação de filamentos de GAC induzidos pela incubação com fosfato inorgânico leva a perda da interação. Além disso, GAC em excesso molar leva a inibição da atividade de PKM2. A formação de um perfil diferencial de partículas de GAC+PKM2 foi observada por Microscopia Eletrônica, sendo um indicativo da formação do complexo. GAC e PKM2 endógenas e expressas ectopicamente em células de mamíferos co-imunoprecipitaram (Co-IP) e mostraram sinais de co-localização, como revelado por ensaio de Duolink PLA. A remoção de GLN levou a alteração no sinal de fluorescência de GAC para uma marcação filamentosa, ocasionando a perda de seu perfil disperso no citoplasma coerente com marcação mitocondrial na presença de GLN. Apesar dos resultados não mostrarem diretamente a filamentação vista em in vitro, os mesmos são compatívies com estas estruturas. Verificamos que, como visto in vitro, a retirada de GLN do meio de cultivo celular levou a perda de sinal do Duolink e de Co-IP, indicativos de interação. Nossos resultados mostram que PKM2 é parceiro de interação de GAC in vitro e em células e que a interação não é favorecida pela filamentação induzida pela privação de GLN. Além disto, GAC diminui a atividade de PKM2 in vitro, implicando um papel de GAC na regulação da via glicolítica Ver menos

Abstract: Neoplastic cells share characteristics acquired during tumor development that are essential for cancer progression. In particular, the reprogramming of tumor metabolism is extremely important to meet the high energy and biosynthetic demand of these cells. Glutaminase enzymes (GLS) are key in this process. GLS convert glutamine (GLN) into glutamate, which in turn serves as a substrate for the formation of alpha ketoglutarate, an intermediate in the Tricarboxylic Acid (TCA) cycle. Thus, GLN is used as an anaplerotic source of TCA metabolic precursors, allowing the accelerated synthesis of biomolecules and tumor aggressiveness gain. Two genes (GLS and GLS2) express four GLS isoforms. In this work, we focus in the variants of GLS, KGA and GAC, due to their importance in the progression of several types of cancers. These isoforms have a molecular structure divided into 3 domains: central glutaminolytic domain, N-terminal and C-terminal domain. In the C-terminal domain of KGA are found protein-protein interaction sequences such as ankirin repeats (ANK) and sequences of the LXXLL type (nuclear receptor box, NRbox), normally found in regulators of transcription factors such as nuclear receptors. The C-terminal domain of GAC, by contrast, is smaller and unstructured. Such molecular structure leads us to believe that GLS isoforms interact with other proteins and participate in biochemical pathways distinct from GLN metabolism and potentially important for the tumor phenotype. Yeast double-hybrid studies previously performed in the laboratory identified the glycolytic enzyme pyruvate kinase M2 (PKM2) as a potential partner of these isoforms. Thus, the aim of this work was to explore the interaction of GAC/KGA with PKM2 and deepen the biochemical description of the findings, as well as in triple negative breast cancer cell lines. We express PKM2 in a heterologous system, purify it, and show by fluorescence anisotropy that it interacts directly with GAC with greater affinity than with KGA, and that the formation of GAC filaments larger than tetramers induced by incubation with inorganic phosphate, leads to loss of interaction. Furthermore, molar excess GAC leads to inhibition of PKM2 activity. The formation of a differential profile of GAC+PKM2 particles was observed by Electron Microscopy, being a possible indication of the formation of the complex. Endogenous and ectopically expressed GAC and PKM2 in mammalian cells co-immunoprecipitated (Co-IP) and showed signs of colocalization, as revealed by Duolink PLA assay. Removal of GLN led to a change in the GAC fluorescence signal to a filamentous signal, with a shift in a scattered cytoplasmic profile consistent with mitochondrial signal in the presence of GLN. Although the results do not directly show the filamentation seen in vitro, they are compatible with these structures. We verified that, as seen in vitro, the removal of GLN from the cell culture medium led to loss of Duolink and Co-IP signal, indicative of interaction. Our results show that PKM2 is an interaction partner of GAC in vitro and in cells and the interaction is not favored by filamentation induced by GLN deprivation. Furthermore, GAC decreases PKM2 activity in vitro, implying a role for GAC in regulating the glycolytic pathway Ver menos