Resumo: O Acidente Vascular Cerebral (AVC) é uma das doenças que mais acomete a população mundial, sendo uma das principais causas de morte e incapacitação. O subtipo isquêmico é o mais frequente, atingindo em torno de 80% dos pacientes com AVC. Apesar de fatores de risco de exposição ambiental terem sido estabelecidos para o AVC, esses contribuem com aproximadamente 60% da probabilidade de desenvolvimento do quadro, mostrando que fatores genéticos também influenciam a ocorrência da doença. Alguns estudos identificaram variantes genéticas comuns putativamente associadas ao fenótipo em pacientes com AVC, porém, a maioria não se classifica como uma variante causal. Além disso, é possível que variantes raras sejam responsáveis por parte da herdabilidade do AVC, contribuindo com uma porcentagem do risco para o seu desenvolvimento. Outro ponto a se considerar é a natureza multifatorial do AVC, onde espera-se uma interação de fatores genéticos e ambientais determinando as alterações biológicas que levam a doença. Essas interações podem gerar biomarcadores moleculares que por sua vez podem ser utilizados na prática clínica auxiliando o diagnóstico ou no estabelecimento do prognóstico para a doença. Desse modo, fatores de risco distintos podem convergir na determinação de mecanismos moleculares comuns, afetando a regulação da expressão gênica em pacientes com AVC. Isso posto, os objetivos desse estudo são: i) avaliar a contribuição de variantes genômicas raras presentes nas regiões codificantes do genoma humano em pacientes com AVC isquêmico. ii) determinar o padrão de expressão de microRNAs circulantes em pacientes com AVC isquêmico, nas fases aguda e crônica da doença, e iii) determinar o padrão metabolômico em plasma de pacientes com AVC isquêmico, nas fases aguda e crônica da doença. Utilizando o sequenciamento de nova geração avaliamos o exoma de 130 pacientes com AVC isquêmico, o padrão de expressão de microRNAs em 154 indivíduos, incluindo 53 controles, e o padrão metabolômico do plasma em 52 indivíduos, incluindo 14 controles. A análise de exoma permitiu a identificação de 523 variantes raras em 53 genes de interesse para o AVC isquêmico, entre eles destacamos COL4A3, COL6A3, FGFR2, FVIII, HLA-B. Esses genes fazem parte prioritariamente das vias de biossíntese de colágeno, coagulação sanguínea, inflamação, angiogênese e integridade vascular. Além disso, identificamos microRNAs circulantes com expressão diferencial em pacientes nas diferentes fases do AVC, sendo que os microRNAs let-7, mir-182 e mir-324 estavam diferencialmente expressos na fase aguda do AVC, enquanto o mir-34c está diferencialmente expresso na fase crônica da doença. Comparando o padrão de expressão dos microRNAs na fase aguda e crônica, observamos alterações nos níveis de expressão dos microRNAs mir-142, mir-16, mir-206 e mir-30a. Também observamos similaridade entre os microRNAs identificados na análise do plasma total e aqueles associados a vesículas extracelulares. Utilizando técnicas de RMN, identificamos metabólitos associados com a fase aguda do AVC como formato, piruvato e GlycA. Por sua vez, na fase crônica, os níveis do glutamato eram diferentes em paciente, quando comparado aos controles. Interessante mencionar que os metabólitos identificados em níveis diferentes nos pacientes possuem relação com os mesmos processos fisiológicos identificados na análise de microRNAs. Em conclusão, identificamos variantes raras em genes de interesse para o AVC, como o USP7, não descrito na literatura para a doença. Estas podem contribuir para os riscos de ocorrência e para a gravidade do AVC isquêmico. Além disso, identificamos microRNAs e metabólitos circulantes específicos para diferentes fases do AVC isquêmico, incluindo algumas moléculas inéditas para o AVC isquêmico, porém, com mecanismos relevantes para a doença. Nossos resultados, indicam potenciais biomarcadores para o AVC isquêmico que após passar por etapas adicionais de validação, possam ser usados no desenvolvimento de estratégias de prevenção, diagnóstico e tratamento para pacientes com AVC isquêmico. Ver menos

Abstract: Stroke is one of the most frequent diseases worldwide and one of the leading causes of death and disability. Ischemic stroke is the most common subtype, affecting around 80% of the patients. Although environmental risk factors have been established to increase the risk of stroke, they contribute only with approximately 60% of the probability of developing the disease. Thus, genetic factors also play a role in the predisposition to stroke. Some studies identified common genetic variants putatively associated with stroke. However, it is also possible that rare variants may contribute to the heritability of the disorder. Furthermore, stroke is a multifactorial disorder, where it is expected an interaction of different genetic and environmental factors to determine the biological alterations leading to disease. These interactions can create molecular biomarkers that, in turn, may be used in clinical practice to assist in the diagnose or to establish disease prognosis. In this way, distinct risk factors might converge to determine common molecular mechanisms, which may affect gene expression regulation in patients with stroke. Therefore, the aims of this study are: i) to evaluate the contribution of rare genetic variants to the risk of developing ischemic stroke; ii) to determine the circulating microRNAs expression pattern in patients with ischemic stroke, in both the acute and chronic stage of the disease; and iii) to determine the metabolomic pattern on plasma samples from patients with ischemic stroke, in both the acute and chronic stage of the disease. Using next-generation sequencing, we evaluated the exome of 130 patients with ischemic stroke, the plasma microRNA expression pattern of 154 individuals, including 53 controls, and the metabolomic pattern from the plasma of 52 individuals, including 14 controls. The exome analysis allowed us to identify 523 rare variants in 53 genes of interest to ischemic stroke, from which we highlight COL4A3, COL6A3, FGFR2, FVIII, HLA-B. These genes are primarily part of the following biological pathways: collagen biosynthesis, blood coagulation, inflammation, angiogenesis, and vascular integrity. Furthermore, we identified circulating microRNAs with a differential expression in different phases of ischemic stroke. The microRNAs let-7, mir-182, and mir-324 were differentially expressed in the acute phase of stroke. In contrast, mir-34c was differentially expressed in the chronic phase of ischemic stroke. Comparing the microRNAs expression pattern on acute and chronic phases, we observed changes in expression levels of microRNAs mir-142, mir-16, mir-206, and mir-30a. We also observed similarities between microRNAs identified in plasma and those associated exclusively with extracellular vesicles. We identified metabolites associated with acute stroke in plasma of patients by NMR techniques, such as formate, pyruvate, and GlycA. During the chronic phase, the level of glutamate was altered in patients when compared to controls. Interestingly, the metabolites identified as differentially abundant in patients are related to similar biological pathways as the microRNAs found to be differentially expressed in patients. In conclusion, we identified rare variants in candidate genes, as USP7, which were not previously identified to ischemic stroke, that may predict the risk of occurrence and the severity of ischemic stroke. Also, we identified circulating microRNAs and metabolites specific for the different stages of ischemic stroke, and that have not been observed in ischemic stroke patients, that should be validated in broader clinical studies. These molecules are potential disease biomarkers and might help, in the future, the development of new strategies to prevent, diagnose and treat patients with ischemic stroke. Ver menos