Caracterização estrutural do transportador ABC Rv1747 de Mycobacterium tuberculosis : estudos sobre interação com a proteína PknF e alterações conformacionais = Structural characterization of the Mycobacterium tuberculosis ABC transporter Rv1747: studies on interaction with the PknF protein and conformational

Sindy Paola Cabarca Barreto

Caracterização estrutural do transportador ABC Rv1747 de Mycobacterium tuberculosis [recurso eletrônico] : estudos sobre interação com a proteína PknF e alterações conformacionais = Structural characterization of the Mycobacterium tuberculosis ABC transporter Rv1747: studies on interaction with the PknF protein and conformational

Sindy Paola Cabarca Barreto

Material

TESE

Idioma

Português

Número de chamada

T/UNICAMP C111c

Título paralelo/equiv.

[Structural characterization of the Mycobacterium tuberculosis ABC transporter Rv1747]

Publicação

Campinas, SP : [s.n.], 2020.

Descrição física

1 recurso online ( 100 p.) : il., digital, arquivo PDF.

Nota geral

Orientador: Andrea Balan Fernandes

Nota de dissertação ou tese

Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia

Resumo Resumo: A tuberculose, é uma doença infecciosa que geralmente afeta os pulmões e é causada pelo bacilo Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Sua complexidade, duração do tratamento e o surgimento de cepas resistentes e multirresistentes, destacam a importância dos estudos sobre os mecanismos de... Ver mais Resumo: A tuberculose, é uma doença infecciosa que geralmente afeta os pulmões e é causada pelo bacilo Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Sua complexidade, duração do tratamento e o surgimento de cepas resistentes e multirresistentes, destacam a importância dos estudos sobre os mecanismos de resistência da bactéria, alvos para o desenvolvimento de novos medicamentos e inibidores de crescimento e infecção mais eficazes. Transportadores do tipo ABC (do inglês ATP-Binding Cassette) apresentam papel fundamental durante a infecção pois, estão relacionados aos mecanismos de aquisição de nutrientes (importadores) como também à extrusão de drogas (exportadores ou bombas de efluxo). O transportador ABC Rv1747 deMtb não tem função conhecida, mas sua presença é requerida para o crescimento da bactéria in vivo. Estudos prévios sugerem seu papel na reciclagem de compostos hidrofóbicos, como drogas e lipídios. Adicionalmente, sua estrutura apresenta dois domínios do tipo Forkhead Associated (FHA-1 e FHA-2), fosforilados pela proteína PknF, uma serina/treonina quinase, possível reguladora da atividade do transportador. Neste contexto, esta pesquisa teve como objetivo caracterizar estruturalmente o transportador ABC Rv1747, especificamente, a sua interação com a proteína PknF (cPknF) e avaliar os possíveis efeitos estruturais e funcionais da fosforilação nos domínios FHA. Nesse sentido, produzimos o domínio FHA e três mutantes fosfomiméticos (FHA_T152E, e FHA_T210E e FHA_T152E/T210E) e o domínio catalítico de PknF (cPknF) na forma solúvel e estável. As alterações estruturais induzidas no domínio FHA como consequência da emulação da fosforilação, bem como da mistura FHA-cPknF, foram avaliadas por modelagem molecular, docking molecular, dicroísmo circular (CD), fluorimetria de varredura diferencial (DFS), fluorêscencia intrínseca de triptofanos, espalhamento de raios X a baixo ângulo (SAXS), cristalografia de raios-X e calorimetria de titulação isotérmica (ITC). Os resultados mostraram que os mutantes fosfomiméticos não sofrem alterações no conteúdo de estrutura secundária, mas diminuição (quenching) da fluorescência intrínseca dos triptofanos, similarmente ao que ocorreu com cPknF fosforilada (cPknF*). Tais alterações foram corroboradas pelas medidas de SAXS, que evidenciaram compactação do domínio FHA nos estados fosfomiméticos, tanto nos mutantes quanto na presença de cPknF*. As mutações nos domínios FHA também afetaram a afinidade pela cPknF, a qual exibiu maior afinidade pelo domínio selvagem (Kd = 0,4 µM) e menor pelo duplo mutante FHA_T152E/T210E (Kd = 9,4 µM).Finalmente, foi possível determinar a estrutura tridimensional de cPknF em complexo com o inibidor de quinases humanas IKK16 a 2.6 Å de resolução, a qual é caracterizada por arquitetura e topologia das quinases do tipo Hanks com os lobos amino (N) e carboxi (C) terminais, entre os quais forma-se a fenda que contém o sítio ativo. As análises de docking molecular com o ATP e a estrutura com o inibidor mostraram conservação em relação àsoutras quinases. O conjunto dos resultados permitiu-nos estabelecer um modelo para aativação do transportador pela quinase. Neste modelo, cPknF* teria como primeiro alvo a T152 próxima ao domínio FHA-1, desencadeando alterações estruturais que levariam à aproximação dos domínios FHA-1 e FHA-2 e, consequente fosforilação da T210. As mudanças conformacionais nos domínios FHA teriam como consequência, alterações nas ATPases, permeases e ativação do transportador. A estrutura da quinase e sua relevância na ativação do transportador abre perspectivas muito interessantes para o estudo destas proteínas comoalvos para o desenvolvimento de inibidores e papel funcional do transportador. Ver menos

Abstract: Tuberculosis is an infectious disease that usually affects the lungs and is caused by the bacillus Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Its complexity, duration of treatment and the emergence of resistant and multiresistant strains, highlight the importance of studies on the... Ver mais Abstract: Tuberculosis is an infectious disease that usually affects the lungs and is caused by the bacillus Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Its complexity, duration of treatment and the emergence of resistant and multiresistant strains, highlight the importance of studies on the bacteria'sresistance mechanisms, targets for the development of new drugs and more effective growth and infection inhibitors. ATP-Binding Cassette (ABC) transporters play a fundamental role during infection because they are related to the mechanisms of nutrient acquisition (importers) as well as to the extrusion of drugs (exporters or efflux pumps). The ABC Rv1747transporter from Mtb has no known function, but its presence is required for the growth of the bacteria in vivo. Previous studies suggest its role in recycling hydrophobic compounds, such as drugs and lipids. Additionally, its structure presents two Forkhead-Associated domains (FHA-1 and FHA-2), phosphorylated by the protein PknF, a serine/threonine kinase, a possible regulator of the activity of the transporter. In this context, this research aimed to structurally characterize the ABC transporter Rv1747, specifically, its interaction with the PknF protein and to evaluate the possible structural and functional effects of phosphorylation in the FHA domains. In this sense, we produced the FHA domain and three phosphomimetic mutants (FHA_T152E, and FHA_T210E and FHA_T152E / T210E) and the catalytic PknF domain (cPknF) in soluble and stable form. The structural changes induced in the FHA domain as a consequence of the emulation of phosphorylation, as well as the FHA-cPknF mixture, were evaluated by molecular modeling, molecular docking, circular dichroism (CD), differential scanning fluorimetry (DFS), intrinsic tryptophan fluoroscopy, scattering of X-rays at low angle (SAXS), X-ray crystallography and isothermal titration calorimetry (ITC). The results showed that the phosphomimetic mutants do not undergo changes in the content of secondary structure but decrease (quenching) of the intrinsic fluorescence of tryptophan, similarly to what occurred with phosphorylated cPknF (cPknF *). Such changes were corroborated by the SAXS measurements, which showed compaction of the FHA domain in phosphomimetic states and an increase in stiffness, both in the mutants and in the presence of cPknF*. Mutations in the FHA domains also affected the affinity for cPknF, which exhibited greater affinity for the wild domain (Kd = 0.4 µM) and lower for the double mutant FHA_T152E / T210E (Kd = 9.4 µM). Finally, it was possible to determine the three-dimensional structure of cPknF in complex with the human kinase inhibitor IKK16 at 2.6 Å resolution, which is characterized by the architecture and topology of Hanks-type kinases with the amino (N) and carboxy (C) lobe termini, including the cleft that contains the active site. The molecular docking analyzes with ATP and the structure with the inhibitor showed conservation in relation to other kinases. The set of results allowed us to establish a model for the activation of the transporter by the kinase. In this model, cPknF* would first target T152 close to the FHA-1 domain, triggering structural changes that would lead to the approximation of the FHA-1 domains of FHA-2 and, consequently, phosphorylation of T210. Conformational changes in the FHA domains would result in changes in ATPases, permeases and transporter activation. The structure of the kinase and its relevance in the activation of the transporter opens very interesting perspectives for the study of these proteins as targets for the development of inhibitors and the functional role of the transporter Ver menos

Nota de sistema

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Assuntos

Mycobacterium tuberculosis

Tuberculose

Transportadores de cassetes de ligação de ATP

Fosforilação

Fatores de transcrição Forkhead

Proteínas quinases

Autoria

Cabarca Barreto, Sindy Paola, 1989-

Balan, Andrea, 1969- Orientador