Desenvolvimento de técnica de imortalização celular para produção de DNA de referência para realização de testes moleculares para variantes Rh e grupos sanguíneos [recurso eletrônico]
Mayra Dorigan de Macedo
TESE
Português
T/UNICAMP M151d
[Development of a cell immortalization technique for the production of reference DNA to perform molecular tests for Rh variants and blood groups ]
Campinas, SP : [s.n.], 2020.
1 recurso online ( 112 p.) : il., digital, arquivo PDF.
Orientador: Lilian Maria de Castilho
Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas
Resumo: A transfusão de hemácias em pacientes com doença falciforme permanece como a principal intervenção no tratamento desta patologia. Contudo, a alta incidência da produção de anticorpos com importância clínica, principalmente como consequência da grande diversidade do lócus RH, resulta em...
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Resumo: A transfusão de hemácias em pacientes com doença falciforme permanece como a principal intervenção no tratamento desta patologia. Contudo, a alta incidência da produção de anticorpos com importância clínica, principalmente como consequência da grande diversidade do lócus RH, resulta em reações transfusionais hemolíticas, o que aumenta a complexidade dos testes de compatibilidade sanguínea. Métodos moleculares têm sido incorporados na rotina imunohematológica complexa e erros poderiam ser evitados com o emprego de painéis de DNA de referência validados. Várias são as formas de obtenção destes painéis. Dentre elas, a transformação de linfócitos B em linhagens celulares linfoblastóides (B-LCLs) pelo vírus Epstein-Barr (EBV), as quais fornecem material ideal para estudos genéticos e fenotípicos, tornando-se fonte ilimitada de biomoléculas. Assim, as B-LCLs têm sido utilizadas como material de referência em estudos genômicos. O objetivo deste trabalho foi identificar variantes do sistema Rh associadas com polimorfismos genéticos nos genes RHD e RHCE em pacientes portadores de doença falciforme e doadores de sangue e obter material genético de referência das mesmas a partir da imortalização de seus linfócitos B. Para isto, o EBV foi obtido a partir do cultivo da linhagem celular B95-8. Determinou-se a carga viral por PCR quantitativo em tempo real (qPCR) a ser utilizado no processo de imortalização. Amostras de sangue total de quatro pacientes portadores de doença falciforme e um doador de sangue foram coletadas e analisadas por genotipagem eritrocitária estendida e pesquisa de variantes RHD e RHCE. Duas amostras (SCS_1981 e VACS_2730) foram enviadas ao Banco de Células do Rio de Janeiro (BCRJ) para imortalização. As demais foram processadas in house, com o isolamento das células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) e avaliação de dois protocolos de imortalização dos linfócitos B pelo EBV: um utilizando meio de transformação com fitohemaglutinina (PHA-M) e outro com ciclosporina A (CsA). Das B-LCLS estabelecidas foram obtidos os DNAs, com posterior liofilização do mesmo e genotipagem eritrocitária pós-imortalização celular por laboratórios externos e in house. Como resultado, a carga viral obtida foi de 1x106 cópias virais/µL. Comparando os dados obtidos dos dois meios de transformação, ambos indicaram prevenir regressão celular. Contudo, ocorreu falha na transformação das células. As células enviadas ao BCRJ foram imortalizadas com sucesso, com confirmação dos genótipos eritrocitários anteriormente identificados. De duas amostras foram obtidos seis alelos RH variantes que produzem anticorpos clinicamente significantes: RHD, RHD*DAR, RHD*DIIIa-CE(4-7)-D, RHCE*ceAR, RHCE*ce(733G), RHCE*ce(48C,733G,1006T). Desta maneira, conclui-se que o estabelecimento das B-LCLs, mesmo demandando longos e difíceis períodos de trabalho pode ser eficiente e necessário no atual cenário das análises moleculares de grupos sanguíneos, uma vez que estas células são relativamente estáveis quanto a mutações genômicas e possuem código genético específico de cada indivíduo
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Abstract: Transfusion therapy in sickle cell disease (SCD) patients remains the main intervention in the treatment of this pathology. However, the high incidence of antibodies production with clinical significance mainly because of the RH locus diversity results in hemolytic transfusion reactions...
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Abstract: Transfusion therapy in sickle cell disease (SCD) patients remains the main intervention in the treatment of this pathology. However, the high incidence of antibodies production with clinical significance mainly because of the RH locus diversity results in hemolytic transfusion reactions which increases the complexity of compatibility tests. Molecular methods have been incorporated into the complex immunohaematological routine and errors could be avoided with the use of validated reference DNA panels. There are several ways to obtain these panels. Among them the transformation of B lymphocytes into B-lymphoblast cell lines (B-LCLs) by the Epstein-Barr virus (EBV) which provides ideal material for genetic and phenotypic studies becoming an unlimited source of biomolecules. Thus, B-LCLs have been used as reference material in genomic studies. The goal of this study was to identify Rh variants associated with genetic polymorphisms in the RHD and RHCE genes in patients with SCD and blood donors, in order to obtain reference genetic material from them through the immortalization of their B lymphocytes. For this, the EBV was obtained from the cultivation of cell line B95-8. We analyzed the viral load by quantitative real-time PCR (qPCR) to be used in the immortalization process. Whole blood samples from four patients with SCD and one blood donor were collected and analyzed by extended red cell genotyping including RHD and RHCE variants. Two samples (SCS_1981 e VACS_2730) were sent to the Cell Bank (BCRJ) from Rio de Janeiro for immortalization. The others were processed in house with the isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and evaluation of two protocols for immortalization of B lymphocytes by EBV: one using transformation medium with phytohemagglutinin (PHA-M) and the other with cyclosporine A (CsA). DNAs were obtained from the established B-LCLS, with subsequent lyophilization and red cell genotyping after cell immortalization was performed by external laboratories and in house. As result the viral load obtained was 1x106 viral copies/µL. Comparing the data obtained from the two transformation media, both indicated to prevent cell regression. However, the cells transformation failed. The cells sent to the BCRJ were successfully immortalized with confirmation of the red cell genotypes previously identified. Six RH variant alleles that produce clinically significant antibodies were obtained from the two samples: RHD, RHD*DAR, RHD*DIIIa-CE(4-7)-D, RHCE*ceAR, RHCE*ce(733G), RHCE*ce(48C,733G,1006T). Thus, we concluded that the establishment of B-LCLs even demanding long and difficult periods of work it is efficient and necessary in the current scenario of molecular analysis of blood groups since these cells are relatively stable in terms of genomic mutations and have specific genetic code of each individual
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Requisitos do sistema: Software para leitura de arquivo em PDF
Castilho, Lilian Maria de
Orientador
Carvalho, Marcelo Addas de
Avaliador
Gilli, Simone Cristina Olenscki
Avaliador
Haddad, Simone Kashima
Avaliador
Arnoni, Carine Prisco
Avaliador
Desenvolvimento de técnica de imortalização celular para produção de DNA de referência para realização de testes moleculares para variantes Rh e grupos sanguíneos [recurso eletrônico]
Mayra Dorigan de Macedo
Desenvolvimento de técnica de imortalização celular para produção de DNA de referência para realização de testes moleculares para variantes Rh e grupos sanguíneos [recurso eletrônico]
Mayra Dorigan de Macedo