Resumo: Uma estratégia promissora para aumentar a eficiência do processo e reduzir os custos na produção de etanol de segunda geração é fermentar em temperaturas acima de 35 ° C, principalmente em configurações otimizadas de processo, como a sacarificação e fermentação simultâneas (SSF) da biomassa lignocelulósica. No entanto, Saccharomyces cerevisiae não cresce eficientemente a altas temperaturas, nem expressa naturamente as enzimas do complexo celulolítico. Portanto, neste estudo, utilizamos a evolução laboratorial 2016/04602-3 adaptativa e a expressão heterologa baseada em CRISPR/Cas9 para selecionar linhagens industriais de S. cerevisiae capazes de crescer e produzir etanol em temperaturas maiores ou iguais a 40 ° C e que possam expressar endoglucanase e ß-glicosidase para a suplementação da sacarificação enzimática da biomassa. Em comparação com as cepas parentais, as linhagens SA-1E e PE-2E tiveram, respectivamente, crescimento celular superior em 63% e 61% a 40 ° C, produzindo um rendimento de etanol de 0,44 g.g-1. A eficiência de transformação variou de 20 a 100%, e as atividades máximas de endoglucanase e ß-glicosidase foram 8,05 U mL -1 e 17,68 U L -1, respectivamente. As estirpes editadas com CRISPR / Cas9 mostraram uma actividade de ß-glicosidase 3 vezes mais elevada em compação com as cepas transformadas com plasmideo. A sacarificação e fermentação simultânea de celulose microcristalina e do bagaço de cana pela cepa AGY005 resultaram em rendimentos de etanol de 47,53 g L-1 e 9,73 g L-1, demonstrando que a engenharia evolutiva e o método CRISPR/Cas9 podem ser usados para desenvolver linhagens termotolerantes recombinantes de S. cerevisiae industriais (diploides) com potencial para fermentar e sacarificar a biomassa lignocelulósica Ver menos

Abstract: A promising strategy to increase process efficiency and reduce costs in the production of second generation ethanol is to carry out the fermentation step at temperatures above 35 ° C, especially in optimized process configurations such as simultaneous saccharification and fermentation (SSF) of the lignocellulosic biomass. However, Saccharomyces cerevisiae does not grow efficiently at high temperatures, nor does it naturally express the enzymes of the cellulolytic complex. Therefore, in this study, we used adaptive laboratory evolution and heterologous expression based on CRISPR / Cas9 to select industrial strains of S. cerevisiae capable of growing and producing ethanol at temperatures greater or equal 40 ° C and that could express endoglucanase and beta-glycosidase for the supplementation of enzymatic saccharification of biomass. Compared to parental strains, SA-1E and PE-2E had, respectively, 63% and 61% growth at 40 ° C, yielding an ethanol yield of 0.44 gg -1. Transformation efficiency ranged from 20 to 100%, and maximal activities of endoglucanase and ß-glycosidase were 8.05 U mL -1 and 17.68 UL -1, respectively. The CRISPR / Cas9 edited strains showed 3-fold higher ß-glucosidase activity compared to the plasmid-transformed strains. Simultaneous saccharification and fermentation of microcrystalline cellulose and sugarcane bagasse by AGY005 resulted in ethanol yields of 47.53 g L-1 and 9.73 g L-1, demonstrating that evolutionary engineering and the CRISPR / Cas9 method can be used to develop industrial thermotolerant S. cerevisiae (diploid) strains with potential to ferment and saccharify the lignocellulosic biomass Ver menos