Resumo: A neuropatia periférica de origem diabética (NDP) acomete 60 % dos pacientes diabéticos e é a causa mais comum de dor neuropática no mundo ocidental. A dor é o principal sintoma da NDP, além da ocorrência de anormalidades da marcha, com alterações na pressão plantar. Existe ainda, uma estreita correlação entre o desenvolvimento da NDP e o aumento de citocinas pró-inflamatórias nos gânglios das raízes dorsais (GRDs), como a interleucina 1? (IL-1?) e o fator de necrose tumoral ? (TNF-?), as quais atuam como ativadoras da via de sinalização das proteínas quinases ativadas por mitógenos (MAPKs), que envolve as proteínas p38, ERK1/2 e c-Jun-N-terminal. Não há tratamento efetivo para a NDP em nível global, exceto o rigoroso controle da hiperglicemia. Dentre outras terapias não-farmacológicas, a Terapia Laser de Baixa Intensidade (do inglês "Low-Level Laser Therapy", LLLT) pode ser uma possível opção de tratamento para a NDP. Contudo, pouco se sabe sobre a influência da LLLT na modulação das vias de sinalização relacionadas à NDP. A partir disso, o objetivo deste estudo foi investigar os mecanismos do efeito anti-hiperalgésico da LLLT em ratos Lewis, portadores de NDP induzida por estreptozotocina (STZ). Os experimentos foram aprovados pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA/UNICAMP), protocolos n. 3902-1 e n. 5337-1/2019. Ratos Lewis isogênicos, machos, 200-250 g, de 4-8 semanas de idade, receberam 5 doses de STZ, 1 dose por dia, durante 5 dias consecutivos (25 mg/kg/dia) ou veículo, tampão citrato de sódio 0,1 M. O diabetes tipo I foi determinado por glicemia ? 250 mg/dL em 48 h após a última injeção de STZ. Ratos diabéticos e controles foram submetidos aos testes de Randall-Selitto, von Frey eletrônico e CatWalk nos dias 0, 7, 14, 21, 24 e 28 após as injeções de STZ ou veículo. Ratos diabéticos hiperalgésicos foram submetidos à LLLT (AsGa, 904 nm; 2,03 J; 70 mW; 29 s) aplicada sobre a região dos GRDs L4-L5, entre os dias 21 e 28. No 28º dia, os ratos foram eutanasiados e os GRDs L4-L5 foram coletados para experimentos de ELISA, RT-qPCR, Western blot, imunofluorescência e espectroscopia Raman. Em paralelo, GRDs de ratos naïve foram usados para cultura primária de neurônios, os quais foram mantidos por 24 h em meio normoglicêmico ou hiperglicêmico e usados para análise da dinâmica de cálcio intracelular, potencial de membrana mitocondrial (MMP), potencial de membrana neuronal por FluoVoltTM, patch clamp whole-cell e ensaio de viabilidade celular por MTT. A LLLT foi capaz de reduzir a intensidade de hiperalgesia mecânica nos ratos com NDP e de restabelecer parâmetros espaciais da marcha, fortemente correlacionados à hiperalgesia [Área da pegada (cm²); Área máxima de contato (cm²); Comprimento da passada (cm)]. A LLLT levou a redução dos níveis de IL-1? e TNF-? no GRD, bem como a expressão de mRNAs para p38 MAPK. Na NDP, houve aumento da fosforilação da proteína p38 MAPK, que foi parcialmente reduzida após a LLLT. Picos do espectro Raman dos GRDs L4-L5, alterados na NDP (2704 cm-1; 2850 cm-1; 2885 cm-1; 3160 cm-1), retornaram à intensidade normal após a LLLT. Neurônios do GRD mantidos em meio hiperglicêmico e expostos à LLLT, apresentaram redução do influxo de cálcio e aumento do MMP, ligado à ativação dos complexos mitocondriais I e III. Não houve influência significativa da LLLT sobre o potencial de membrana neuronal. A LLLT não afetou a viabilidade celular dos neurônios do GRD. De maneira geral, a LLLT apresentou efeito benéfico no tratamento da NDP, pois foi capaz de atuar positivamente sobre as suas principais alterações comportamentais, celulares, moleculares e espectrais Ver menos

Abstract: Peripheral diabetic neuropathy (PDN) occurs in 60 % of the diabetic patients, and it is considered the most common cause for neuropathic pain in the western world. Pain is the most common symptom of PDN, and the occurrence of gait alterations is also very frequent, which includes plantar pressure impairments. There is a strong correlation between the development of PDN and the increase in the concentration of proinflammatory cytokines, such as IL-1? and TNF-? in the dorsal root ganglia (DRG). These cytokines are linked to the activation of mitogen activated protein kinases (MAPKs) cascade, including p38, ERK1/2, and c-Jun-N-terminal proteins. There is no efficient treatment for NDP at a global level, except the rigorous hyperglycemia control. Among other non-pharmacological therapies, the Low-Level Laser Therapy (LLLT) could be an interesting option for the PDN treatment. However, there is little information about the influence of LLLT on the modulation of signaling pathways related to the PDN development and maintenance. Based on that, the aim of this study was to investigate the anti-hyperalgesic effect mechanisms of LLLT applied in streptozotocin (STZ)-induced diabetic neuropathic Lewis rats. All the experiments were approved by the UNICAMP Ethics Committee (CEUA), protocols n. 3902-1 and 5337-1/2019. Male isogenic Lewis rats, 200-250 g, 4-8-week-old, received 5 low-doses of STZ, 1 dose per day, during 5 consecutive days (25 mg/kg/day), or STZ vehicle, 0.1 M sodium buffer citrate. Type-1 diabetes was determined by the occurrence of glycemia ? 250 mg/dL at 48 h after the last STZ injection. Diabetic and control rats were submitted to Randall-Selitto, electronic von Frey, and CatWalk tests, at 0, 7, 14, 21, 24, and 28 days after the beginning of STZ or vehicle injections. Diabetic hyperalgesic rats were submitted to LLLT (GaAs, 904 nm; 2.03 J; 70 mW; 29 s), applied over the rats shaved skin at the dorsal region of L4-L5 DRG, bilaterally, between the 21st and the 28th days of the experimental protocol. At the 28th day, rats were euthanized and the L4-L5 DRG were collected and processed for ELISA, RT-qPCR, Western blot, immunofluorescence, and Raman spectroscopy analyses. In parallel, DRG from naïve rats were used for primary cell culture of afferent neurons, which were kept during 24 h under low- (5.5 mM of glucose) or high-glucose (55 mM of glucose) cell media, and used for calcium imaging, mitochondrial membrane potential (MMP), neuronal membrane potential through FluoVoltTM, patch clamp whole-cell and MTT cell viability assay. LLLT treatment was able to reduce the intensity of mechanical hyperalgesia in diabetic neuropathic rats, and to restore altered spatial gait parameters, strongly correlated to hyperalgesia [Print area (cm²); Max. contact area (cm²); Stride length (cm)]. LLLT treatment reduced the levels of DRG IL-1? and TNF-?, and the p38 MAPK mRNA expression. PDN was accompanied by the p38 MAPK phosphorylation, which was partially reduced by LLLT. Altered peaks from DRG Raman spectra of diabetic neuropathic rats (2704 cm-1; 2850 cm-1; 2885 cm-1; 3160 cm-1) showed normal intensities after LLLT treatment. DRG neurons kept in hyperglycemic medium and exposed to LLLT, showed reduced calcium influx and increased MMP, related to mitochondrial complexes I and III. There was no significant influence over the neuronal membrane potential. LLLT did not affect the cell viability of DRG neurons. In general, there were beneficial effects of LLLT in the treatment of PDN, once the therapy was able to act, positively, over behavioral, cellular, molecular, and spectral alterations Ver menos