Avaliação da capacidade máxima da cadeia transportadora de elétrons mitocondrial em linhagens de células tumorais [recurso eletrônico] = Evaluation of the maximum capacity of the mitochondrial electron transport chain in tumor cell lines
Juliana Silveira Ruas
TESE
Multilíngua
T/UNICAMP R821a
[Evaluation of the maximum capacity of the mitochondrial electron transport chain in tumor cell lines]
Campinas, SP : [s.n.], 2019.
1 recurso online (107 p.) : il., digital, arquivo PDF.
Orientador: Roger Frigério Castilho
Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas
Resumo: A capacidade do sistema transportador de elétrons mitocondrial em células intactas é estimada pela taxa máxima de consumo de oxigênio (OCRmax) induzida por protonóforos. Esta estimativa geralmente é precedida pelo uso de inibidores da ATP sintase. O presente trabalho objetivou reportar e...
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Resumo: A capacidade do sistema transportador de elétrons mitocondrial em células intactas é estimada pela taxa máxima de consumo de oxigênio (OCRmax) induzida por protonóforos. Esta estimativa geralmente é precedida pelo uso de inibidores da ATP sintase. O presente trabalho objetivou reportar e elucidar o mecanismo pelo qual inibidores da ATP sintase causam subestimação do OCRmax e, consequentemente, da capacidade de reserva respiratória (SRC, diferença entre o OCRmax e basal). Ainda, objetivou-se o estabelecimento de um protocolo experimental que permitisse a estimativa do OCRmax na presença de inibidores da ATP sintase. Os experimentos foram realizados com linhagens de células, sendo a maior parte deles com células originárias de glioblastoma humano (T98G e U-87MG). O consumo de oxigênio por células em suspensão foi estimado em oxígrafo de alta resolução equipado com eletrodo de Clark, enquanto para células aderidas utilizou-se um sistema automatizado de leitura de placas contendo sensores de detecção fluorimétrica de oxigênio. Os resultados demonstraram que a presença dos inibidores da ATP sintase oligomicina (0,3¿3 µg/mL) ou citreoviridina (20 µM) leva a subestimação do OCRmax com consequente diminuição do SRC em células em suspensão ou aderidas, em meio contendo 5,5 ou 11 mM de glicose. A presença ou ausência de bicarbonato de sódio e soro fetal bovino durante as análises não teve influência no efeito inibitório de bloqueadores da ATP sintase no OCRmax, bem como no SRC. O efeito inibitório da oligomicina sobre o OCRmax foi abolido quando somente glutamina foi utilizada como substrato respiratório ou quando o inibidor glicolítico 2-deoxi-glicose esteve presente. A concentração de ATP diminuiu e a razão ADP/ATP aumentou em células tratadas com protonóforos, mas essas alterações foram minimizadas quando a oligomicina esteve presente. Este efeito da oligomicina indica a participação da atividade reversa da ATP sintase na diminuição dos níveis de ATP e aumento da razão ADP/ATP em células tratadas com protonóforos. Tal conclusão foi corroborada utilizando-se duas concentrações de citreoviridina, onde uma baixa concentração (5 µM), que afeta apenas a atividade de síntese da ATP sintase não levou a subestimação do OCRmax, enquanto uma alta concentração (20 µM), que inibe tanto a atividade de síntese como o reverso da ATP sintase, resultou em subestimação do OCRmax. A exposição de células permeabilizadas com digitonina a ATP exógeno, mas não a ADP, resultou em inibição parcial do OCRmax induzido por protonóforos. Por fim, foi estabelecido que uma adição prévia de 2-deoxi-glicose à titulação do protonóforo, mesmo após a inibição do OCR basal pela oligomicina, permite que os parâmetros OCRmax e SRC sejam determinados sem o efeito inibitório ocasionado por inibidores da ATP sintase. Concluímos que a subestimação do OCRmax e SRC quando há inibição da ATP sintase está associada a uma alta atividade glicolítica e que o ATP glicolítico pode ter um efeito inibitório sobre o metabolismo de substratos respiratórios e/ou na atividade da citocromo c oxidase. Diante de situações onde a mitocôndria está desacoplada por protonóforos, inibidores da ATP sintase preservam o ATP intracelular pela inibição da atividade reversa deste complexo
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Abstract: The capacity of the mitochondrial electron transport system in intact cells is frequently estimated by promoting protonophore-induced maximal oxygen consumption (maxOCR) preceded by the addition of the ATP synthase inhibitor oligomycin. This study sought to report and elucidate how ATP...
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Abstract: The capacity of the mitochondrial electron transport system in intact cells is frequently estimated by promoting protonophore-induced maximal oxygen consumption (maxOCR) preceded by the addition of the ATP synthase inhibitor oligomycin. This study sought to report and elucidate how ATP synthase blockers lead to underestimation of maxOCR and spare respiratory capacity (SRC, i.e. the difference between maxOCR and basal). Also, it was aimed to establish an experimental protocol that would allow the estimation of maxOCR in the presence of ATP synthase inhibitors. The experiments were performed with cell lines, mostly with human glioblastoma cell lines (T98G and U-87MG). The oxygen consumption by suspended cells was estimated in a high-resolution oxygraph equipped with a Clark electrode, while for attached cells an automated plate reader system equipped fluorimetric oxygen sensors was used. The results demonstrated that the presence of oligomycin (0.3-3.0 µg/mL) or citreoviridin (20 µM) led to underestimation of maxOCR and a consequent decrease in SRC values in suspended or attached cells in medium containing 5.5 or 11 mM glucose. The presence or absence of sodium bicarbonate and fetal bovine serum during analyzes had no influence on the inhibitory effect of ATP synthase blockers on maxOCR as well as on SRC. The inhibitory effect of oligomycin on CCCP-induced maxOCR did not occur when glutamine was the metabolic substrate or when the glycolytic inhibitor 2-deoxy-glucose was present. ATP concentration was reduced and ADP/ATP ratio increased in cells treated with protonophores, but these changes were minimized when oligomycin was present. This effect of oligomycin suggests the participation of the reverse activity of ATP synthase in the decrease of ATP levels and increase in ADP/ATP ratio in protonophore-treated cells. This conclusion was corroborated by using two concentrations of citreoviridin, where a low concentration (5 ?M), which only affects the forward activity of ATP synthase, did not lead to underestimation of maxOCR, whereas a high concentration (20 ?M), which inhibits both the forward and reverse activity of ATP synthase, resulted in an underestimation of maxOCR. Exposing digitonin-permeabilized cells to exogenous ATP, but not ADP, resulted in partial inhibition of protonophore-induced maxOCR. Finally, it was established that an addition of 2-deoxy-glucose previous to protonophore titration, even after inhibition of basal OCR by oligomycin, allows the determination of maxOCR and SRC without the inhibitory effect caused by oligomycin. We conclude that underestimation of maxOCR and SRC in tumor cells when ATP synthase is inhibited is associated with high glycolytic activity and that the glycolytic ATP yield may have an inhibitory effect on the metabolism of respiratory substrates and cytochrome c oxidase activity. Under conditions where mitochondria are uncoupled by protonophores, inhibitors of ATP synthase preserve intracellular ATP levels by inhibiting the reverse activity of this complex
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Requisitos do sistema: Software para leitura de arquivo em PDF
Castilho, Roger Frigério, 1972-
Orientador
Uyemura, Sergio Akira
Avaliador
Rodrigues, Tiago
Avaliador
Bassani, Rosana Almada, 1955-
Avaliador
Avaliação da capacidade máxima da cadeia transportadora de elétrons mitocondrial em linhagens de células tumorais [recurso eletrônico] = Evaluation of the maximum capacity of the mitochondrial electron transport chain in tumor cell lines
Juliana Silveira Ruas
Avaliação da capacidade máxima da cadeia transportadora de elétrons mitocondrial em linhagens de células tumorais [recurso eletrônico] = Evaluation of the maximum capacity of the mitochondrial electron transport chain in tumor cell lines
Juliana Silveira Ruas