Resumo: Exossomos são nanopartículas importantes na comunicação intercelular, carregando conteúdos de proteínas, RNAs e microRNAs que recapitulam as células de origem. Assim, poderiam ser úteis como pulso antigênico no desenvolvimento de novas formas de imunoterapia, e análise de seu conteúdo interno poderia representar uma interessante ferramenta prognóstica. O objetivo deste estudo foi avaliar o uso de exossomos extraídos do soro de pacientes com leucemia mieloide aguda (LMA) e síndromes mielodisplásicas (SMD) como fonte antigênica para células dendríticas (DC) e os efeitos sobre a citotoxicidade antitumoral. Além disso, os níveis de expressão de mir-223, importante microRNA no sistema hematopoiético, foram avaliados nos exossomos e correlacionados com dados clínicos e laboratoriais, com o intuito de explorar seu potencial uso prognóstico nessas doenças. Sangue venoso foi obtido de 14 pacientes com LMA, 28 pacientes com SMD e 19 controles saudáveis. Exossomos foram isolados usando método ExoQuick®; sua concentração e distribuição de tamanho foram caracterizadas por Nanoparticle Tracking Analysis (NanoSight, UK). Os níveis de expressão de mir-223 e mir-192 (controle endógeno) foram avaliados por RT-PCR. Para os estudos de citotoxicidade, 100µL da suspensão de exossomos (aproximadamente 1015 nanopartículas) foram incubados com DCs maduras ou imaturas e a citotoxicidade direta ou dependente de linfócitos foi avaliada pela porcentagem de lise específica de células leucêmicas K562 nas coculturas, comparado a situações de DCs não pulsadas. A concentração de exossomos nas amostras de soro variou de 5,6 x 1011 a 3,3 x 1013 partículas por ?l de suspensão, com concentrações significativamente menores nas amostras de pacientes em relação aos indivíduos saudáveis (p= 0,004). Diminuição significativa na expressão de mir-223 foi observada em exossomos de indivíduos com SMD de alto risco em comparação com controles (p= 0,002) e doença de baixo risco (p= 0,012). Curiosamente, houve correlação positiva significativa entre expressão de mir-223 exossomal e contagens de: leucócitos totais (rs de Spearman = 0,37, p = 0,003), neutrófilos (rs= 0,392, p = 0,002), monócitos (rs= 0,484, p <0,001), linfócitos (rs= 0,442, p <0,001) e plaquetas (rs= 0,387, p = 0,002). A diferenciação granulocítica-monocítica de células CD34+ humanas normais revelou aumento de 8 vezes na expressão de mir-223 nessas células após 14 dias de cultura. Em relação aos estudos citotóxicos, surpreendentemente, a incubação de exossomos de pacientes com DCs diminuiu a lise das células-alvo, provavelmente correspondendo a mecanismo de evasão tumoral in vivo. No entanto, quando DCs imaturas foram pulsadas com exossomos purificados de sobrenadantes de culturas de K562 ou lisados dessas células, a lise de células alvo foi notavelmente aumentada, associada a aumento substancial na expressão do marcador de maturação CD83. Portanto, o desenvolvimento de vacinas usando exossomos de pacientes provavelmente não acrescentaria benefícios ao tratamento da LMA; alternativamente, exossomos de células em cultura ou lisados celulares podem representar formas eficazes de maturar DCs em fenótipo citotóxico, sem a imunossupressão observada com exossomos dos pacientes. Além disso, mir-223 está suprimido em pacientes com SMD de alto risco e correlaciona-se com as contagens celulares tanto em SMD quanto LMA. Como os níveis de mir-223 aumentam progressivamente durante a diferenciação granulocítica-monocítica, especulamos que mir-223 pode representar um marcador de diferenciação residual normal Ver menos

Abstract: Exosomes are nanoparticles with important intercellular communication functions, carrying proteins, RNAs and microRNAs which are dependent on the cells of origin. Thus, they could be useful as antigenic pulse in the development of new forms of immunotherapy, and the analysis of their microRNAs contents could represent a more accessible prognostic tool. The objective of this study was to evaluate the use of exosomes extracted from serum of patients with acute myeloid leukemia (AML) and myelodysplastic syndromes (SMD) as an antigenic source for dendritic cell (DC) and the effects upon antitumor cytotoxicity. Furthermore, expression levels of exosomal mir-223, an important microRNA in the hematopoietic system, were correlated to clinical and laboratorial data. Venous blood was obtained from 14 patients with AML, 28 patients with MDS and 19 healthy controls. Exosomes were isolated using the ExoQuick® precipitation solution; their concentration and size distribution were characterized by Nanoparticle Tracking Analysis (NanoSight, UK). Expression levels of mir-223 and mir-192 (endogenous control) were assessed by RT-PCR using specific primers. For cytotoxic studies, 100uL of the suspension of exosomes (approximately 1015 nanoparticles) were incubated with mature or immature DCs in culture and direct or lymphocyte-dependent cytotoxicity was assessed by the percentage of specific lysis of K562 leukemic cells in co-cultures, compared to that of non-pulsed DCs, and analyzed by immunophenotyping. The concentration of exosomes in serum samples ranged from 5.6 x 1011 to 3.3 x 1013 particles per ?l of suspension, with significantly lower concentrations in the patient¿s samples in relation to healthy individuals (p=0.004). A significant decrease in the expression of mir-223 was observed in exosomes from individuals with high-risk MDS compared to controls (p=0.002) and to patients with low-risk MDS (p=0.012). Interestingly, in the total group of patients, there was a significant positive correlation between the expression of exossomal mir-223 and counting of: total leukocytes (Spearman's rs=0.37, p=0.003), neutrophils (rs=0.392, p=0.002), monocytes (rs=0.484, p<.001), lymphocytes (rs=0.442, p<.001) and platelets (rs=0.387, p=0.002) in peripheral blood. We then performed granulocytic-monocytic differentiation of normal human CD34+ cells and observed an 8-fold increase in mir-223 expression in cultured cells after 14 days of culture. Regarding the cytotoxic studies, surprisingly, incubation of patients¿ exosomes with DCs decreased lysis of target cells, which may correspond to a mechanism of tumor evasion in vivo. However, when immature DCs were pulsed with exosomes purified from K562 culture supernatants or K562 cell lysates, the lysis of target cells was notably enhanced, associated with a substantial increase in the expression of the maturation marker CD83. Thus, the development of vaccines using patients' exosomes would probably add no benefits to the treatment of AML; alternatively, exosomes from cultured cells or whole cell lysates may represent effective ways for maturing DCs into a cytotoxic phenotype, without the immunosuppression observed with patients' exosomes. Furthermore, mir-223 is suppressed in exosomes of patients with high-risk MDS and correlate with cell counts in both MDS and AML. As mir-223 levels progressively increase during normal granulocytic-monocytic differentiation, we speculate that mir-223 may represent a marker of residual normal differentiation Ver menos