Resumo: O manguezal é um dos biomas mais importantes para a manutenção da vida nos mares e o equilíbrio da biosfera. O sedimento do mangue é uma grande fonte de novos recursos genéticos para pesquisa. Estes ambientes têm sofrido impacto antropogênico por muito tempo, principalmente a poluição causada por derramamento de petróleo. Diversos estudos estão sendo conduzidos para explorar o potencial genético destas comunidades com a finalidade de desenvolver novos processos biotecnológicos para o tratamento de ambientes contaminados. Dentro deste contexto, este trabalho visou identificar e caracterizar genes que codificam dioxigenases, proteínas envolvidas na degradação de hidrocarbonetos aromáticos, a partir de clones fosmidiais de uma biblioteca metagenômica construída de sedimento de mangue impactado por petróleo do município de Bertioga-SP. A coleta e processamento das amostras ambientais, juntamente com a construção da biblioteca metagenômica fosmidial, foi realizada previamente no âmbito do projeto FAPESP "Prospecção de metagenoma microbiano de sedimentos de manguezais na busca por novos compostos bioativos" (Processo no. 2011/50809-5). O DNA metagenômico das amostras de sedimento, coletadas em triplicata, foi extraído e usado em reações de PCR para a construção de bibliotecas dos genes de dioxigenases que hidroxilam anéis aromáticos (ARHDs) e análise de seus padrões de distribuição biogeográfico. O DNA total da biblioteca fosmidial foi isolado e sequenciado em plataforma Illumina para prospecção in silico de genes envolvidos no metabolismo de compostos aromáticos. Ainda, os clones fosmidiais foram submetidos a uma triagem preliminar por colorimetria, baseada no uso do composto MTT [3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2 H-tetrazolium bromide] (Merck) e, posteriormente, ensaios de degradação de hidrocarbonetos por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG-EM) para confirmar e quantificar a atividade de degradação de hidrocarbonetos aromáticos (fenol, naftaleno, fenantreno, pireno e benzopireno) dos clones. O DNA fosmidial dos clones com melhor potencial de degradação foi sequenciado e processado para montagem de grandes fragmentos metagenômicos. Caracterização estrutural e funcional dos insertos metagenômicos foram feitos nas plataformas RAST e IMG, para elucidação de clusters gênicos envolvidos na degradação de hidrocarbonetos aromáticos. Alvos gênicos foram isolados, ligados em vetor de expressão pET28a(+) e transformados em cepas de E. coli BL21(DE3) e Rosetta. A análise da diversidade dos genes ?-ARHD revelou que Pseudomonas, Streptomyces, Variovorax, Bordetella e Rhodococcus foram os cinco gêneros mais abundantes entre os 15 sítios analisados. A análise de distribuição biogeográfica revelou forte endemismo de algumas Operational Protein Families (OPF) de alfa-ARHD em cada região geográfica e uma considerável proximidade evolutiva entre OPFs encontradas em sítios da Antártica e da América do Sul. O sequenciamento da biblioteca fosmidial permitiu identificar um total de 71.729 sequências metagenômicas parciais na categoria SEED para metabolismo de compostos aromáticos (1% do total). Estas foram classificadas nas subcategorias Anaerobic degradation of aromatic compounds (20,34%), Metabolism of central aromatic intermediates (35,40%), e Peripheral pathways for catabolism of aromatic compounds (22,56%). Além disso, foi evidenciado o predomínio das dioxigenases de Catecol, Protocatecuato e Homogentisato, envolvidas no metabolismo central, e das dioxigenases de Fenilpropionato, Lignostilbeno, Bifenil e Benzoato envolvidas nas vias periféricas de degradação de aromáticos. As análises de bioinformática dos dados de sequenciamento dos clones fosmidiais potencialmente degradadores revelaram uma interessante diversidade de genes envolvidos direta e indiretamente no metabolismo de compostos aromáticos. Os ensaios de cromatografia mostraram a eficiência de 3 clones na degradação de fenol (98%), pireno (75%) e naftaleno (71%). Os clones contendo os genes alvos para dioxigenases apresentaram sinais positivos nos testes de expressão. Os resultados deste trabalho permitiram elucidar a riqueza, distribuição e relação genética entre os genes ARHD de diferentes sítios ao redor do mundo. Além disso, a avaliação da biblioteca metagenômica pelas diferentes técnicas empregadas, revelou seu extenso potencial genético para o metabolismo de compostos aromáticos Ver menos

Abstract: Mangrove is one of the most important biomes for the maintenance of life in the seas and the balance of the biosphere. Mangrove sediment is a major source of new genetic resources for research. These environments have long been suffering anthropogenic impacts, especially pollution caused by oil spills. Many microbial species are able to degrade petroleum compounds, and several studies are being conducted to explore the genetic potential of these communities with the purpose of developing new biotechnological processes for the treatment of contaminated environments. In this context, this work aimed to identify and characterize genes encoding dioxygenases, proteins involved in the degradation of aromatic hydrocarbons, from fosmid clones of a metagenomic library constructed from oil-impacted mangrove sediments located in the city of Bertioga-SP. Sampling and further processing of environmental samples, together with the metagenomic fosmid library construction, were performed previously under the project "Bioprospecting microbial metagenome from mangrove sediments in the search for novel bioactive compounds" (FAPESP Process no. 2011/50809-5). Metagenomic DNA from sediment samples, collected in triplicate, was extracted and used in PCR reactions for the assembly of Aromatic Ring-Hydroxylating Dioxygenases (ARHDs) gene library and analysis of their biogeographic distribution patterns. Total fosmid DNA was isolated and sequenced on the Illumina platform for in silico prospecting of genes involved in the metabolism of aromatic compounds. Further, fosmid clones were subjected to a preliminary colorimetric screening, based on the use of the compound 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2 H-tetrazolium bromide (MTT, Merck) and, subsequently, to hydrocarbon degradation assays by gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC-MS) to confirm and quantify the aromatic hydrocarbon degradation activity (phenol, naphthalene, phenanthrene, pyrene and benzopyrene) of the clones. Fosmid DNA from clones with the best degradation potential was sequenced and processed for the assembly of large metagenomic fragments. Further structural and functional characterization of the metagenomic inserts was performed in the RAST and IMG platforms, to elucidate gene clusters involved in the aromatic hydrocarbon degradation. Gene targets were isolated, ligated into pET28a (+) expression vector and transformed into E. coli strains BL21 (DE3) and Rosetta. Diversity analysis of the ?-ARHD genes revealed that Pseudomonas, Streptomyces, Variovorax, Bordetella and Rhodococcus were the five most abundant genera harboring dioxygenases among the 15 sites analyzed. The biogeographic distribution analysis revealed strong endemism of some Operational Protein Families (OPF) of alpha-ARHD in each geographic region and a significant evolutionary relatedness between OPFs found in sites of Antarctica and South America. Sequencing of the fosmid library allowed the identification of a total of 71,729 partial metagenomic sequences in the SEED category for the metabolism of aromatic compounds (1% of the total). These were classified in the categories of Anaerobic degradation of aromatic compounds (20.34%), Metabolism of central aromatic intermediates (35.40%), and Peripheral pathways for catabolism of aromatic compounds (22.56%). In addition, we have demonstrated the predominance of Catechol, Protocatechuate and Homogentisate dioxygenases involved in central metabolism, and the dioxygenases of Phenylpropionate, Lignostilbene, Biphenyl and Benzoate involved in the peripheral pathways of aromatics degradation. Bioinformatics analyzes of sequencing data from potentially degrading fosmid clones revealed an interesting diversity of genes involved directly or indirectly in the aromatic compounds metabolism. Chromatography assays showed the efficiency of three clones in the degradation of phenol (98%), pyrene (75%) and naphthalene (71%). Clones containing the target genes for dioxygenase showed positive signals in expression tests. The results of this work allowed to elucidate the richness, distribution and genetic relationships among ARHD genes from different sites around the world. In addition, the evaluation of the metagenomic library by the different techniques employed revealed its extensive genetic potential for the aromatic compounds metabolism Ver menos