Resumo: Tem havido um grande interesse na determinação das vias de sinalização envolvidas na proliferação celular e função secretora das células beta pancreáticas para aplicação deste conhecimento em terapias moleculares e celulares na diabetes. Em especial, a via de sinalização Wnt canônica ou Wnt/beta-catenina, que apresenta a proteína beta-catenina como uma molécula sinalizadora juntamente com a Wnt, foi recentemente relacionada à diabetes tipo 2 quando foi descoberta em humanos uma relação entre a diabetes e mutações no gene que codifica o fator de transcrição TCF7L2 dessa via. Nós observamos previamente uma possível ativação dessa via, revelada pelo aumento significativo do conteúdo proteico de  beta-catenina ativada e Ciclina D1/2, em ilhotas hiperplásicas de animais pré-diabéticos, alimentados por 60 dias com uma dieta hiperlipídica (HFD, do inglês High-Fat Diet). Até então, não havia estudos que comprovassem diretamente o envolvimento desta via de sinalização no processo de hiperplasia compensatória da célula beta durante a pré-diabetes experimental. Sendo assim, esta Tese de Doutorado visou investigar a ativação da via Wnt canônica durante a hiperplasia compensatória da massa de célula beta observada na fase inicial da diabetes mellitus tipo 2 em modelo in vivo e expandir para um modelo in vitro. Para isso, foram realizadas as seguintes etapas experimentais: 1) a caracterização metabólica de camundongos C57BL/6/JUnib expostos à HFD por 30 ou 60 dias e seus controles (CTL 30d ou CTL 60d) alimentados com ração padrão pelo mesmo período de tempo; 2) a análise da ativação da via Wnt canônica em ilhotas hiperplásicas (obtidas de animais expostos à HFD 60d) e não hiperplásicas (obtidas de animais expostos à HFD 30d) e em ilhotas dos respectivos controles, por meio de imunofluorescência em criocortes do pâncreas, Western Blot, RT-PCR e qPCR de genes/proteínas associados à via Wnt canônica em homogenizados de ilhotas isoladas; 3) a análise da expressão gênica dos 19 subtipos de Wnts por RT-PCR e qPCR em homogenizados de ilhotas isoladas, do pâncreas total e do tecido adiposo peripancreático (controle positivo) dos camundongos expostos à HFD 60d e do seu grupo controle (CTL 60d), além de embriões de 12 dias (controle positivo); 4) a análise, por imunofluorescência em criocortes do pâncreas desses animais, da expressão proteica de determinados Wnts, selecionados na etapa anterior, para se determinar em quais tipos celulares do pâncreas/ilhotas são expressos, e por fim; 5) experimentos in vitro com a linhagem de células beta MIN6 para analisar se a co-cultura com ilhotas hiperplásicas (do grupo HFD) ou não hiperplásicas (do grupo CLT) tem efeito sobre a proliferação e/ou função secretora da célula beta desta linhagem. Nossos resultados confirmaram que os camundongos alimentados com HFD por 60 dias apresentaram alterações metabólicas características da pré-diabetes tipo 2. No grupo dos animais HFD 60d (com ilhotas hiperplásicas), além de um aumento no conteúdo proteico de ?-catenina ativada e Ciclina D1/2, há uma translocação nuclear da  beta-catenina nas células beta e um aumento significativo na expressão de mRNA de Ctnnb1 (beta-catenina), Ccnd1 (Ciclina D1), Ccnd2 (Ciclina D2), c-Myc, Ins2 (Insulina 2) e Coup-TFII, associado com diminuição do inibidor Axina2, em homogenizados de ilhotas isoladas desses animais em relação aos grupos HFD 30d e controle. Esses resultados confirmam a ativação da via Wnt canônica durante a hiperplasia compensatória das células beta. Ainda, no grupo dos animais HFD 60d e no grupo CTL, a análise da expressão gênica dos 19 subtipos de Wnts revelou que a maioria deles são expressos nas células das ilhotas, como os Wnts 2, 2b, 3, 3a, 4, 5a, 5b, 6, 7a, 7b, 8a, 8b, 9a, 9b e 11, e que, no pâncreas, há expressão desses mesmos subtipos com exceção dos Wnts 3, 6, 7a e 7b. Entre todos os Wnts, os Wnts: 3a e 5b apresentaram um aumento significativo da expressão gênica em ilhotas hiperplásicas de camundongos HFD em comparação aos CTL, e o Wnt8b demonstrou ser expresso especificamente pelas células beta das ilhotas pancreáticas no grupo controle. Em adição, observamos que a co-cultura da linhagem MIN6 com ilhotas hiperplásicas ou não hiperplásicas não alterou significativamente a função secretora das células beta MIN6, mas induziu o aumento significativo da proliferação celular nesta linhagem in vitro. Essa indução da proliferação celular, no entanto, foi parcialmente bloqueada pelos inibidores Wnt, IWR-1 e IWP-2. Em conclusão, nossos dados indicam que a via de sinalização Wnt canônica está ativada durante o processo de hiperplasia compensatória da célula beta na pré-diabetes, e que Wnts liberados possivelmente por células das ilhotas podem estar envolvidos nesse processo Ver menos

Abstract: There has been a great interest in determining the signaling pathways involved in cell proliferation and secretory function of the pancreatic beta cells for applying this knowledge in molecular and cellular therapies of diabetes. In particular, the canonical Wnt or Wnt/beta-catenin signaling pathway, which has the beta-catenin as a signaling molecule together with Wnts, has recently been associated to the onset of type 2 diabetes mellitus (T2DM). A link has been described between diabetes and mutations in the gene encoding the TCF7L2 transcription factor of the Wnt pathway. We have previously observed a possible activation of this pathway revealed by a significant increase in the protein content of active beta-catenin and Cyclin D1/2 in hyperplastic islets of prediabetic animals fed a high-fat diet (HFD) for 60 days. Besides this observation, studies directly addressing the involvement of this signaling pathway in the process of compensatory beta-cell hyperplasia seen during experimental prediabetes are limited. Therefore, this Ph.D. Thesis aimed at investigating the activation of the canonical Wnt pathway during the compensatory hyperplasia of the beta-cell mass observed during the early phase of T2DM using in vivo and in vitro models. For this purpose, the following steps were performed: 1) the metabolic characterization of C57BL/6/JUnib mice exposed to HFD for 30 or 60 days and their respective control groups (CTL 30d or CTL 60d) fed a chow diet for the same period of the time; 2) the analysis of the activation of the canonical Wnt pathway in hyperplastic islets (obtained from animals exposed to HFD 60d) and non-hyperplastic islets (obtained from animals exposed to HFD 30d) and in islets of the respective control groups, by means of immunofluorescence, Western Blot, RT-PCR and qPCR of genes/proteins associated with the canonical Wnt pathway in isolated islet homogenates; 3) the analysis of the gene expression of all 19 Wnt subtypes (described in mice) by RT-PCR and qPCR in homogenates of isolated islets, whole pancreas and peripancreatic adipose tissue (positive control for the Wnts) obtained from the animals exposed to HFD 60d and their controls (CTL 60d), as well as whole 12-day mouse embryos (positive control for the Wnts) homogenates; 4) the immunofluorescence of some Wnts, screened in the previous step, to determine in which pancreas/islet cell types they are expressed, and finally; 5) in vitro experiments with MIN6 beta cell lineage were performed to analyze whether co-culture with hyperplastic or control islets has an effect on the proliferation and/or secretory function of this beta cell lineage. Our results confirmed that mice fed a HFD for 60 days display metabolic changes characteristic of type 2 prediabetes. In the HFD 60d group (with hyperplastic islets), a significant increase in the protein content of active beta-catenin and Cyclin D1/2 was seen as well as a nuclear translocation of beta-catenin in beta cells and a significant increase in the expression of mRNA of Ctnnb1 (beta-catenin), Ccnd1 (Cyclin D1), Ccnd2 (Cyclin D2), c-Myc, Ins2 (Insulin 2) and Coup-TFII, as well as a decrease in Axin2, in isolated islet homogenates from these animals in relation to the CTL 60d group. These results confirm the activation of the canonical Wnt pathway during the compensatory beta-cell hyperplasia. In addition, the analysis of the gene expression of the 19 Wnt subtypes showed that the majority of Wnts are expressed in hyperplastic and non-hyperplastic islets, such as Wnt subtypes 2, 2b, 3, 3a, 4, 5a, 5b, 6, 7a, 7b, 8a, 8b, 9a, 9b and 11, and that, in the pancreas, there is expression of these same subtypes, except for Wnts 3, 6, 7a and 7b. Among all the Wnts, the Wnt3a and Wnt5b showed a significantly increased expression in hyperplastic islets of prediabetic mice when compared to CTL mice, and Wnt8b was shown to be expressed specifically by pancreatic beta cells. Furthermore, under in vitro conditions, we observed that co-culture with hyperplastic or non-hyperplastic islets did not significantly change the secretory function of the MIN6 beta cells but induced a significant increase in cell proliferation in this lineage, which was partially blocked by the Wnt inhibitors IWR-1 and IWP-2. In conclusion, we demonstrated that murine pancreas/islet cells can secrete Wnts and that Wnts released by islets may participate in the regulation of the beta-cell mass under type 2 prediabetes induced by HFD Ver menos