Resumo: Lignina, um dos materiais mais recalcitrantes da natureza, consiste em um polímero tridimensional composto de vários anéis aromáticos ligados por ligações do tipo éter, estando presente em combinação com celulose e hemicelulose na parede celular vegetal. A lignina se encontra fortemente associada a polissacarídeos da parede celular, o que dificulta seu aproveitamento e praticamente inviabiliza seu isolamento na forma não alterada. Vanilina é um dos produtos da oxidação de lignina, e é obtida na forma natural a partir da vagem de orquídeas tropicais do gênero Vanilla. Devido à sua baixa produtividade e à dificuldade de cultivo fora de seu habitat natural, a demanda mundial por este produto vem sendo atendida através de síntese química a partir de recursos não renováveis como guaicol e ácido glioxílico. Recentemente, rotas fermentativas naturais têm sido desenvolvidas para a produção de vanilina a partir de fontes renováveis. Dada a importância comercial da molécula de vanilina, associada à demanda pela substituição de matérias primas não renováveis por matérias primas renováveis de baixo custo, é proposto neste trabalho o estabelecimento e caracterização de um consórcio de micro-organismos degradadores de lignina como estratégia para a valorização deste subproduto. Este consórcio foi criado através do cultivo de micro-organismos oriundos de solo de canavial em meio de cultura contendo uma solução de compostos provenientes de lignina. Esta solução é obtida através do processo de delignificação do bagaço de cana-de-açúcar, e é composta majoritariamente de compostos fenólicos de baixo peso molecular. Com o sequenciamento metagenômico do consórcio, foi possível ter acesso às enzimas e vias metabólicas envolvidas em processos de bioconversão destes compostos fenólicos. Como método para validação desta estratégia para a prospecção de enzimas lignolíticas, foram selecionadas as enzimas feruloil-CoA sintetase (fcs) e enoil-CoA hidratase/aldolase (ech), seguido de ensaios enzimáticos com estas enzimas para avaliar a capacidade de conversão de ácido ferúlico em vanilina. A caracterização do consórcio revelou a capacidade dos micro-organismos presentes de degradar compostos fenólicos de baixo peso molecular do meio de cultura. Uma subsequente análise taxonômica indicou o enriquecimento do consórcio, com a diminuição da diversidade de micro-organismos em relação à amostra original de solo, e o aumento de espécies descritas na literatura como relacionadas à degradação de compostos aromáticos. Desta maneira, pode se observar a especialização do consórcio através da seleção de micro-organismos aptos a degradarem a lignina presente no meio. A análise do metagenoma do consórcio também permitiu a identificação de enzimas que participam na degradação de lignina e compostos aromáticos, tais como lacases, peroxidases e outras enzimas envolvidas no metabolismo de hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs). A partir dos dados de sequenciamento metagenômico, realizou-se a seleção in silico por análise de similaridade de sequência três enzimas feruloil-CoA sintetase (fcs) e duas enoil-Coa hidratase/aldolase (ech). Através de análises de eletroforese capilar e espectrometria de massas, verificou-se a produção de vanilina a partir de ácido ferúlico em ensaios enzimáticos com as enzimas selecionadas. Em paralelo, foram isolados micro-organismos capazes de crescer de forma autônoma em meios contendo lignina e com possível atividade lignolítica. Em especial, a cepa isolada de Paenarthrobacter sp. (denominada de HW13) se mostrou capaz de crescer em meio de cultura contendo apenas lignina kraft como fonte de carbono. Esta cepa foi também testada quanto a capacidade de crescimento/tolerância a diversos compostos fenólicos de reconhecida toxidade, bem como teve seu genoma sequenciado e comparado com um genoma de Paenarthrobacter obtido a partir dos dados de sequenciamento metagenômico do consórcio, revelando um alto grau de similaridade. Desta maneira, foi mostrado neste trabalho que a estratégia de estabelecimento de um consórcio degradador de lignina, aliado ao acesso de enzimas lignolíticas dos micro-organismos pelo isolamento dos mesmos e por ferramentas de metagenômica, consistem em formas efetivas de se obter rotas de bioconversão de compostos aromáticos oriundos de lignina. A obtenção de enzimas presentes nestas rotas possui o potencial de valorização da lignina de bagaço de cana através da conversão desta em moléculas de maior valor agregado Ver menos

Abstract: Lignin, one of nature's most recalcitrant materials, consists of a three-dimensional polymer composed of various aromatic rings bound by ester-like bonds, being present in combination with cellulose and hemicellulose in the plant cell wall. Lignin is strongly associated with polysaccharides of the cell wall, which makes difficult its use and isolation in an unchanged form. Vanillin is one of the products of lignin oxidation, and is obtained in the natural form from the pod of tropical orchids of the genus Vanilla. Due to its low productivity and the difficulty of growing outside its natural habitat, the world demand for this product has been met through chemical synthesis from non-renewable resources such as guaicol and glyoxylic acid. Recently, natural fermentative routes have been developed for the production of vanillin from renewable sources. Given the commercial importance of the vanillin molecule, associated to the demand for the substitution of non-renewable raw materials for low cost renewable raw materials, it is proposed in this work the establishment and characterization of a consortium of lignin degrading microorganisms as a strategy for the valorization of this sub-product. This consortium was created through the cultivation of microorganisms from sugar cane fields in a culture medium containing a solution of compounds from lignin. This solution is obtained through the process of delignification of sugarcane bagasse, and is composed mainly of phenolic compounds of low molecular weight. With the metagenomic sequencing of the consortium, it was possible to have access to the enzymes and metabolic pathways involved in the bioconversion processes of these phenolic compounds. As a method to validate this strategy for the prospection of lignolytic enzymes, feruloil-CoA synthetase (fcs) and enoyl-CoA hydratase / aldolase (ech) enzymes were selected and evaluated for the conversion capacity of ferulic acid to vanillin. The characterization of the consortium revealed the ability of the present microorganisms to degrade low molecular weight phenolic compounds from the culture medium. A subsequent taxonomic analysis indicated the enrichment of the consortium, with the decrease of the diversity of microorganisms in relation to the original soil sample, and the increase of species described in the literature as related to the degradation of aromatic compounds. In this way, the specialization of the consortium can be observed through the selection of microorganisms able to degrade the lignin present in the medium. The analysis of the metagenome of the consortium also allowed the identification of enzymes involved in the degradation of lignin and aromatic compounds, such as laccases, peroxidases and other enzymes involved in polycyclic aromatic hydrocarbon metabolism (PAHs). From the metagenomic sequencing data, three enzymes feruloil-CoA synthetase (fcs) and two enoyl-Coa hydratase / aldolase (ech) were performed in silico by sequence similarity analysis. Capillary electrophoresis and mass spectrometry analyzes showed the production of vanillin from ferulic acid in enzymatic assays with the selected enzymes. In parallel, microorganisms capable of growing independently in media containing lignin and with possible lignolytic activity were isolated. In particular, the isolated strain of Paenarthrobacter sp. (referred to as HW13) was shown to be capable of growing in culture medium containing only kraft lignin as the carbon source. This strain was also tested for growth / tolerability to various phenolic compounds of recognized toxicity, as well as having its genome sequenced and compared to an Paenarthrobacter genome obtained from the metagenomic sequencing data of the consortium, revealing a high degree of similarity. Therefore, it was shown in this work that the strategy of establishing a lignin degrading consortium, together with the access of lignolytic enzymes of the microorganisms by their isolation and by metagenomic tools, consists of effective ways of obtaining bioconversion routes of aromatic compounds derived from lignin. The obtaining of enzymes present in these routes has the potential of valorization of the sugarcane bagasse lignin through the conversion of this into molecules of greater added value Ver menos