Resumo: A miogênese é um processo que envolve mudanças progressivas a partir de células progenitoras localizadas nos somitos dos embriões de vertebrados. Estas células, conhecidas como mioblastos, passam por uma etapa inicial de intensa proliferação celular para, em seguida, diferenciar-se formando miócitos que se fundem para compor fibras musculares contráteis. O sucesso destas diferentes etapas depende de um complexo panorama de expressão gênica, que envolve a atividade de marcadores moleculares com funções bem estabelecidas. Dentre eles, estão marcadores associados com: 1) o comprometimento da linhagem miogênica e proliferação das células progenitoras (Pax3 e Myf-5), 2) início da diferenciação celular (MyoD, Miogenina, Miostatina), 3) diferenciação terminal e formação das fibras musculares contráteis (cadeia pesada da miosina ¿ MyHC) e 4) marcadores reguladores do ciclo celular (p21), bem como o gene endógeno GAPDH. No presente estudo utilizou-se amostras de tecido da musculatura peitoral de embriões de galinha nos estádios 8, 11, 14 e 17 do desenvolvimento embrionário e células de cultura primária de mioblastos de galinha. Dada a carência de informações sobre a expressão dos marcadores moleculares clássicos da miogênese, o objetivo deste trabalho foi estabelecer o padrão de expressão gênica da Miostatina (Mstn), a distribuição espacial e o conteúdo proteico da MSTN, importante regulador do crescimento e desenvolvimento da musculatura esquelética, e dos demais marcadores selecionados nesse estudo ao longo das diferentes etapas da miogênese esquelética. Para tanto, a atividade dos marcadores selecionados foi definida, primeiramente, por RT-PCR e, em seguida, foi feita a quantificação da expressão gênica por qRT-PCR, tanto em tecidos, modelo in vivo, quanto em células, modelo in vitro. Posteriormente, realizou-se um estudo da distribuição espacial da proteína MSTN, em tecidos e em células, bem como a análise do conteúdo proteico, em tecidos. Além disso, realizou-se uma caracterização morfológica da miogênese fetal em galinha (dias 8, 11, 14 e 17) para observar as modificações que ocorrem ao longo do desenvolvimento. Os resultados confirmaram a expressão gênica da Mstn durante todas as etapas da miogênese fetal em galinha, tanto em tecidos (dias de desenvolvimento embrionário 8, 11, 14 e 17) quanto em cultura primária de mioblastos (cinco dias de diferenciação celular). Quanto aos marcadores moleculares, no modelo in vivo, ocorreu aumento gradual do p21 em consonância com o aumento da expressão da Mstn; Pax3 apresentou indução no dia 11 e teve uma queda acentuada no dia 17; Myf-5 manteve-se constante ao longo dos dias; Myod e Miogenina apresentaram aumento da expressão no dia 11, precedendo o pico de expressão da Mstn no dia 14; MyHC aumentou sua expressão nas etapas mais avançadas do desenvolvimento, com destaque para o dia 17. Em contrapartida, no modelo in vitro, o p21 teve aumento progressivo de sua expressão ao longo dos 5 dias de cultura, em oposição à Mstn; Pax3 e Myf-5 apresentaram maior expressão nos dias 1 e 2 da cultura; Myod e Miogenina tiveram maior expressão nos primeiros dias de cultura; MyHC apresentou-se muito mais expresso nos dias 4 e 5 de cultura celular. Em tecidos, os estudos de expressão gênica corroboraram com os dados obtidos nas etapas seguintes, onde foi observado, por imuno-histoquímica, a distribuição espacial da proteína e a confirmação do conteúdo proteico da MSTN. Enquanto que em células, o resultado obtido por meio da imunocitoquímica não foi conforme o esperado, visto que as células da cultura celular não apresentaram níveis detectáveis da proteína MSTN. O último ensaio produzido neste trabalho, com co-cultura de mioblastos primários fetais com organoides de fibroblastos de galinha, revelou que podem ser os fibroblastos, presentes na co-cultura, que parecem expressar a MSTN, contudo, por ser um achado inédito, serão necessários estudos futuros para comprovar essa hipótese levantada Ver menos

Abstract: Myogenesis is a process that progressively evolves into the development of progenitor cells in vertebrate embryos. These cells, known as myoblasts, undergo a first stage of cell proliferation and then differentiate into myocytes that fuse together to form contractile muscle fibers. The success of these steps depends on a complex panorama of gene expression, which involves the activity of function markers with well-established functions. Among them, markers associated with: 1) the impairment of myogenic taxation and proliferation of progenitor cells (Pax3 and Myf-5), 2) onset cell differentiation (MyoD, Myogenin, Myostatin), 3) terminal differentiation and formation of fibers (MyHC), and 4) markers regulators of the cell cycle (p21), as well as the endogenous gene GAPDH. Tissue samples from the pectoral muscles of chicken embryos were used in stages 8, 11, 14 and 17 of the embryonic development and primary culture cells of chicken myoblasts. The aim of this study was to establish the gene expression pattern of Myostatin (Mstn), the spatial distribution and protein content of MSTN, an important regulator of skeletal muscle growth and development, and the lack of information on the expression of classical molecular markers of myogenesis and the other selected markers mentioned above, along the different stages of skeletal myogenesis. The activity of the selected markers was firstly defined by RT-PCR and then the quantification of the gene expression by qRT-PCR, in tissues, in vivo model, and in cells, in vitro model. Subsequently, a study of the spatial distribution of MSTN protein in tissues and cells, as well as the analysis of the protein content, was carried out in tissues. In addition, a morphological characterization of fetal myogeny in chicken (days 8, 11, 14, and 17) was performed to observe the changes occurring throughout development. The results confirmed the gene expression of Mstn during all stages of fetal chicken myogenesis in both tissues (embryonic development days 8, 11, 14 and 17) and in myoblast primary culture (five days of cell differentiation). As for the molecular markers, of the in vivo model, there was a gradual increase of p21 in consonance with the increase of Mstn expression; Pax3 presented induction on day 11 and had a sharp drop on day 17; Myf-5 remained constant throughout the days; Myod and Myogenin showed increased expression on day 11, preceding the Mstn expression peak on day 14; MyHC increased its expression in the more advanced stages of development, especially on day 17. In contrast, in the in vitro model, p21 had progressive increase of its expression during the 5 days of culture, as opposed to Mstn; Pax3 and Myf-5 showed higher expression on days 1 and 2 of the culture; Myod and Miogenina had greater expression in the first days of culture; MyHC showed much more expression on days 4 and 5 of cell culture. In tissues, gene expression studies corroborated the data obtained in the following steps, where the spatial distribution of the protein and the confirmation of the protein content of MSTN were observed by immunohistochemistry. However in cells, the result evidenced by immunocytochemistry was not as expected, since cells from the cell culture did not have detectable levels of the MSTN protein. The last assay produced in this work, using co-culture of fetal primary myoblasts with organoids of chicken fibroblasts, revealed that the presence of MSTN may be due to the fibroblasts, present in the co-culture, that seem to express MSTN. Since this is an unprecedented finding, future studies should be carried out to prove this hypothesis Ver menos