Efeitos do ácido valproico sobre a metilação do DNA durante o ciclo celular de células HeLa [recurso eletrônico] : Valproic acid effects on DNA methylation during the cell cycle of HeLa cells
Marina Amorim Rocha
DISSERTAÇÃO
Português
T/UNICAMP R582e
[Valproic acid effects on DNA methylation during the cell cycle of HeLa cells]
Campinas, SP : [s.n.], 2018.
1 recurso online (68 p.) : il., digital, arquivo PDF.
Orientador: Maria Luiza Silveira Mello
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia
Resumo: O ácido valproico (VPA), fármaco largamente utilizado como anticonvulsivo, é conhecido como inibidor de deacetilases de histonas, além de exercer outros efeitos ao nível do DNA e de histonas. Em células HeLa, o processo de demetilação de citosinas modificadas do DNA, induzido pelo VPA, é...
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Resumo: O ácido valproico (VPA), fármaco largamente utilizado como anticonvulsivo, é conhecido como inibidor de deacetilases de histonas, além de exercer outros efeitos ao nível do DNA e de histonas. Em células HeLa, o processo de demetilação de citosinas modificadas do DNA, induzido pelo VPA, é matéria de discussão, se por via ativa, com participação de enzimas da família das ten-eleven-translocation (TET), ou por via passiva (dependente da replicação do DNA), por inibição de DNA metiltransferases (DNMTs). No presente estudo, este processo foi investigado ao longo do ciclo celular de células HeLa sincronizadas ou não, tratadas com VPA 1 mM e 20 mM por 4 h e comparado ao de células tratadas com um agente geralmente utilizado como controle de demetilação passiva do DNA (5-aza-CdR 5 µm por 28 h). Em células não sincronizadas, tratadas com VPA e 5-aza-CdR o estudo da progressão do ciclo celular e dos níveis de 5-metilcitosina (5mC) foram investigados por citometria de fluxo. Para células sincronizadas com lovastatina e/ou ácido mevalônico, tratadas com as drogas e coletadas na fase G1 e S, os níveis de metilação do DNA foram avaliados por citometria de fluxo, ELISA e imunocitoquímica. O derivado de 5mC avaliado por citometria de fluxo foi a 5-hidroximetilcitosina (5hmC); por imunocitoquimica, além de 5hmC investigou-se também a 5-carboxilcitosina (5caC) e a 5-formilcitosina (5fC). O PCR quantitativo em tempo real foi realizado a fim de acessar informações a respeito dos níveis de expressão gênica da DNA metiltransferase 1 (DNMT1) e de enzimas da família das TET, TET1 e TET2. Nas condições experimentais utilizadas, os tratamentos com VPA e 5-aza-CdR não induziram citotoxicidade, avaliada por MTT, porém afetaram a progressão do ciclo celular. Conclui-se que o VPA atua na demetilação do DNA predominantemente por via ativa, pois induz superexpressão gênica de TET1 e TET2, diminuição na abundância de 5mC, bem como aumento na abundância de 5hmC, tanto em células paradas em G1 como em células proliferativas. Contudo, como o VPA afetou o perfil de expressão de DNMT1, admite-se que possa também atuar na via passiva da demetilação do DNA. Por outro lado, embora a 5-aza-CdR reduza a expressão gênica de DNMT1, na dependência das células estarem replicando o conteúdo de DNA, e não afeta a expressão gênica de TET1 e TET2 em nenhuma das fases do ciclo celular, ela induz aumento na abundância de 5hmC. Tal achado indica que a 5-aza-CdR possa atuar também na via ativa de demetilação do DNA, possivelmente induzindo o recrutamento das TETs ao DNA. Quanto às marcas de 5caC e 5fC, não se detectou efeito induzido pelos tratamentos com VPA ou com a 5-aza-CdR. Desde que o VPA pode reduzir os padrões de metilação do DNA de células HeLa não replicantes, de maneira dose-dependente salienta-se uma importante implicação potencial de seu uso para a reversão terapêutica da metilação do DNA em tecido nos quais não haja mais participação do processo de divisão celular
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Abstract: Valproic acid (VPA), a drug widely prescribed as an anticonvulsant, is known as a histone deacetylase inhibitor besides exerting other effects at the DNA and histone levels. In HeLa cells, the VPA-induced DNA demethylation process involving modified cytosines is still a matter of...
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Abstract: Valproic acid (VPA), a drug widely prescribed as an anticonvulsant, is known as a histone deacetylase inhibitor besides exerting other effects at the DNA and histone levels. In HeLa cells, the VPA-induced DNA demethylation process involving modified cytosines is still a matter of discussion, if by an active pathways, with the participation of ten-eleven-translocation (TET) enzymes, or by a DNA replication-dependent passive pathway, with inhibition of DNA methyltransferases (DNMTs). In the present study, this process was investigated throughout the cell cycle of synchronized and non-synchronized HeLa cells treated with 1 mM and 20 mM VPA for 4 h and compared to the cell cycle of cells treated with an agent generally used as a control of passive DNA demethylation (5-aza-CdR 5 µM for 28 h). In VPA- and 5-aza-CdR-treated non-synchronized cells, the cell cycle progression and the 5-methylcytosine levels (5mC) were investigated using flow cytometry. For cells synchronized with lovastatin and/or mevalonic acid, followed by treatment with the drugs and collected in the G1 and S phases, the DNA methylation levels were evaluated using flow cytometry, ELISA and immunocytochemistry. The 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) derivative was evaluated using flow cytometry; 5-carboxylcytosine (5caC) and 5-formylcytosine (5fC) were also investigated, using immunocytochemistry. Real-time quantitative PCR was performed to access information regarding gene expression levels of DNA methyltransferase 1 (DNMT1) and enzymes of the TET family (TET1 and TET2). Under present experimental conditions, the VPA and 5-aza-CdR treatments did not induce cytotoxicity, as evaluated by the MTT assay, but affected the progression of the cell cycle. It is concluded that in HeLa cells, VPA acts predominantly on the DNA demethylation process through an the active pathway, because it induces TET1 and TET2 gene overexpression, a decrease in the 5mC abundance, as well as an increase in the 5hmC abundance, either in G1 cells or in proliferative cells. However, since VPA also affected the expression profile of DNMT1, it is assumed that it may also act in the passive DNA demethylation pathway. On the other hand, although 5-aza-CdR reduces the DNMT1 gene expression, depending on whether the cells are replicating their DNA content, and does not affect the gene expression of TET1 and TET2 at any stage of the cell cycle, it induces an increase in the abundance of 5hmC. This finding indicates that 5-aza-CdR may also act in the active pathway of DNA demethylation, possibly inducing the recruitment of TETs to DNA. Regarding the 5CaC and 5fC tags, no detectable effect was induced by the VPA or the 5-aza-CdR treatments. Because VPA can reduce the DNA methylation patterns of non-replicating HeLa cells in a dose-dependent manner, a significant potential implication of its use is suggested for the therapeutic reversal of DNA methylation in tissues where no further participation of the process of cell division occurs
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Efeitos do ácido valproico sobre a metilação do DNA durante o ciclo celular de células HeLa [recurso eletrônico] : Valproic acid effects on DNA methylation during the cell cycle of HeLa cells
Marina Amorim Rocha
Efeitos do ácido valproico sobre a metilação do DNA durante o ciclo celular de células HeLa [recurso eletrônico] : Valproic acid effects on DNA methylation during the cell cycle of HeLa cells
Marina Amorim Rocha