Ativação da Guanilil Ciclase Solúvel associada à inibição da proteína de resistência a multidrogas-4 (MRP4) como estratégia antiplaquetária em humanos [recurso eletrônico]
Camila Bitencourt Mendes Silvério
DISSERTAÇÃO
Português
T/UNICAMP Si39a
[Activation of Soluble Guanylyl Cyclase with inhibition of multidrug resistence protein inhibitor-4 (MRP4) as a new antiplatelet therapy]
Campinas, SP : [s.n.], 2018.
1 recurso online (86 p.) : il., digital, arquivo PDF.
Orientadores: Edson Antunes, Fabíola Taufic Mónica Iglesias
Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas
Resumo: É bem estabelecido que a ativação da via de sinalização óxido nítrico (NO) - guanilil ciclase solúvel (GCs) - GMP cíclico (GMPc) resulta em inibição plaquetária. Proteínas de resistência a multidrogas (MRP), incluindo MRP-4, estão presentes na membrana plasmática e nos grânulos densos...
Ver mais
Resumo: É bem estabelecido que a ativação da via de sinalização óxido nítrico (NO) - guanilil ciclase solúvel (GCs) - GMP cíclico (GMPc) resulta em inibição plaquetária. Proteínas de resistência a multidrogas (MRP), incluindo MRP-4, estão presentes na membrana plasmática e nos grânulos densos plaquetários, sendo capazes de transportar ativamente nucleotídeos cíclicos (AMPc e GMPc) do interior para o exterior celular. O efluxo de nucleotídeos cíclicos pelos MRPs supostamente contribui para a manutenção dos níveis basais dos mesmos em condições fisiológicas. Nesse estudo levantamos a hipótese que a associação do BAY 60-2770 (potente ativador da GCs) com o MK 571 (potente inibidor do MRP4) resulta em inibição sinérgica da ativação plaquetária, constituindo-se, portanto em nova estratégia farmacológica antiplaquetária. Desta forma, o objetivo do presente estudo foi investigar a agregação plaquetária induzida pelo colágeno ou trombina e marcadores de ativação plaquetária na presença de BAY 60-2770 e MK 571. Para tanto, utilizamos suspensões de plaquetas humanas de voluntários sadios (1,5 x 108 plaquetas/mL). As plaquetas foram incubadas com MK 571 (10 µM) ou veículo (0,5% de DMSO) por 3 min, após os quais adicionaram-se BAY 60-2770 (0,001 a 10 µM) por mais 3 min. Em seguida, as plaquetas foram ativadas com colágeno (2 µg/mL) ou trombina (0,1 U/mL). Realizamos ensaios de agregação plaquetária, mobilização de Ca2+ e liberação de ATP. Quantificamos os níveis de GMPc, AMPc e tromboxano B2 (TXB2) por meio de kits ELISA. Determinamos o grau de ativação da integrina plaquetária, 'alfa'IIbß3, utilizando-se anticorpo específico, PAC-1. Ensaios de Western blotting para a quantificação protéica da VASP, AKT, ERK, JNK e P38 foram também realizados. A pré-incubação com MK 571, nas concentrações de 10 µM, não interferiu de modo significativo na agregação plaquetária induzida por colágeno ou trombina. Por outro lado, na concentração de 30 µM, o MK 571 inibiu significativamente a agregação plaquetária. Concentrações de 10 e 30 µM de MK 571 também não interferiram na atividade da PDE5A. Para os próximos experimentos, selecionamos a concentração de 10 µM de MK 571. BAY 60-2770 (0,001 - 10 µM) produziu inibição significativa da agregação plaquetária induzida pelo colágeno ou trombina, bem como da liberação de ATP. Ambos os efeitos (agregação e liberação de ATP) foram marcantemente potencializados pela pré-incubação com MK 571 (10 µM). Pré-incubação das plaquetas com probenecida (inibidor inespecífico de MRP) também potencializou os efeitos antiagregantes do BAY 60-2770 em plaquetas ativadas com colágeno e trombina. A associação do MK 571 com BAY 60-2770 também resultou em níveis menores de TXB2, particularmente na ativação plaquetária pela trombina. O BAY 60-2770 (0,001 ¿ 10 µM) aumentou os níveis de GMPc, sendo tal efeito potencializado pelo MK 571, para ambos os agonistas plaquetários. O BAY 60-2770 aumentou significativamente a fosforilação do resíduo de Ser239 da VASP, sendo potencializada pelo MK 571. Os níveis de AMPc não foram alterados de modo significativo quer pelo MK 571 quer pelo BAY 60-2770, individualmente ou associados. O BAY 60-2770 (0,01 a 10 µM) reduziu os níveis de Ca2+ (níveis totais e intracelulares) os quais foram potencializados pela pré-incubação com MK 571. A ativação da integrina 'alfa'IIbß3 pelo colágeno ou trombina foi inibida significativamente pelo BAY 60-2770, e da mesma forma o grau de inibição da mudança de conformação desta integrina foi maior quando na presença de MK 571. BAY 60-2770 individualmente não alterou a fosforilação das AKT, ERK, p38. A associação MK 571 e BAY 60-2770 inibiram somente a fosforilação da JNK nas maiores concentrações de BAY 60-2770 estudadas. Assim, nosso estudo mostra que a associação do MK 571 e BAY 60-2770 podem ter grande interesse terapêutico na prevenção de doenças aterotrombóticas associadas a complicações tromboembólicas
Ver menos
Abstract: It is well established that the activation of the signaling pathway nitric oxide (NO) - soluble guanylil cyclase (GCs) - cyclic GMP (cGMP) results in platelet inhibition. Multidrug resistance proteins (MRPs), including MRP-4, are present in the plasma membrane and in dense granules, being...
Ver mais
Abstract: It is well established that the activation of the signaling pathway nitric oxide (NO) - soluble guanylil cyclase (GCs) - cyclic GMP (cGMP) results in platelet inhibition. Multidrug resistance proteins (MRPs), including MRP-4, are present in the plasma membrane and in dense granules, being able to actively transport cyclic nucleotides (cAMP and cGMP) from the inside to the cell exterior. The efflux of cyclic nucleotides by MRPs supposedly contributes to the maintenance of their basal levels under physiological conditions. In this study, we hypothesized that the association of BAY 60-2770 (potent GC activator) with MK 571 (potent inhibitor of MRP4) results in synergistic inhibition of platelet activation, thus constituting a new antiplatelet pharmacological strategy. Thus, the objective of the present study was to investigate collagen or thrombin-induced platelet aggregation and platelet activation markers in the presence of BAY 60-2770 and MK 571. For this, we used human platelet suspensions from healthy volunteers (1.5 x 108 platelets/ml). Platelets were incubated with MK 571 (10 µM) or vehicle (0.5% DMSO) for 3 min, after which BAY 60-2770 (0.001 to 10 µM) was added for a further 3 min. The platelets were then activated with collagen (2 µg/ml) or thrombin (0.1 U/ml). We performed platelet aggregation assays, Ca2+ mobilization and ATP release. We quantified the levels of cGMP, cAMP and thromboxaneB2 (TXB2) by ELISA kits. We determined the degree of activation of the platelet integrin, 'alpha'IIbß3, using specific antibody, PAC-1. Western blotting assays for the protein quantification of VASP, AKT, ERK, JNK and P38 were also performed. Preincubation with MK 571, at concentrations of 10 µM, did not significantly interfere with collagen or thrombin-induced platelet aggregation. On the other hand, at the concentration of 30 µM, MK 571 produced significant inhibition of platelet aggregation. Concentrations of 10 and 30 µM of MK 571 also did not interfere with the activity of PDE5A. For the next experiments, we selected the 10 µM concentration of MK 571. BAY 60-2770 (0.001 - 10 µM) produced significant inhibition by collagen or thrombin-induced platelet aggregation, as well as the release of ATP. Both inhibition effects (aggregation and ATP release) were markedly potentiated by preincubation with MK 571 (10 µM). Preincubation of platelets with probenecid (non-specific inhibitor of MRP) also potentiated the antiaggregant effects of BAY 60-2770 on platelets activated with collagen and thrombin. The association of MK 571 with BAY 60-2770 also resulted in lower levels of TXB2, particularly platelet activation by thrombin. BAY 60-2770 (0.001 - 10 ?M) increased total cGMP levels, and this effect was potentiated by MK 571 for both platelet agonists. BAY 60-2770 significantly increased the phosphorylation of the VASP Ser239 residue, which were potentiated by MK 571. The cAMP levels were not significantly altered by both MK 571 and BAY 60-2770, individually or in combination. BAY 60-2770 (0.01 to 10 µM) reduced Ca2+ levels (total and intracellular levels) which were potentiated by preincubation with MK 571. Activation of 'alpha'IIbß3 integrin by collagen or thrombin was significantly inhibited by BAY 60 -2770, and likewise the degree of inhibition of this integrin was greater when in the presence of MK 571. BAY 60-2770 individually did not alter the phosphorylation of AKT, ERK, p38 and JNK. The association MK 571 and BAY 60-2770 inhibited only the phosphorylation of JNK in the highest concentrations of BAY 60-2770 studied. Thus, our study shows that the association of MK 571 and BAY 60-2770 may have great therapeutic interest in the prevention of atherothrombotic diseases associated with thromboembolic complications
Ver menos
Requisitos do sistema: Software para leitura de arquivo em PDF
Antunes, Edson, 1960-
Orientador
Mónica, Fabíola Zakia, 1980-
Coorientador
Gambero, Alessandra, 1972-
Avaliador
Werneck, Claudio Chrysostomo, 1966-
Avaliador
Marcondes, Sisi, 1966-
Avaliador
Rodrigues, Gerson Jhonatan
Avaliador
Ativação da Guanilil Ciclase Solúvel associada à inibição da proteína de resistência a multidrogas-4 (MRP4) como estratégia antiplaquetária em humanos [recurso eletrônico]
Camila Bitencourt Mendes Silvério
Ativação da Guanilil Ciclase Solúvel associada à inibição da proteína de resistência a multidrogas-4 (MRP4) como estratégia antiplaquetária em humanos [recurso eletrônico]
Camila Bitencourt Mendes Silvério