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Resumo: Os jasmonatos (JAs) são compostos derivados de lipídeos que regulam o crescimento, o desenvolvimento e a resposta a estresses em plantas. Sua principal atividade é a indução da expressão gênica, embora pouco seja conhecido sobre os componentes que ativam e os que transmitem sinais que desencadeiam respostas fisiológicas. Através da técnica de macroarranjos de DNA, estudamos a expressão de 1536 ESTs de cana-de-açúcar em resposta à aplicação de metil-jasmonato (MeJA). Mudanças significativas foram observadas em 26 ESTs, cujas seqüências codificam proteínas que atuam na fotossintese, senescência, síntese protéica e resposta a estresses, além de proteínas com funções desconhecidas. Uma dessas enzimas catalisa a produção de sinapoilmalato. um composto de defesa contra UV. Entre as novas proteínas com domínios de sinalização, encontramos uma proteína zinc finge r (SCZF), que foi estudada mais detalhadamente, sendo esta induzida também por ABA e mais expressa em plantas com menor teor de sacarose. Além dos macroarranjos. usamos a técnica de data-mining para estudar o banco de dados do SUCEST, a procura de vias metabólicas relacionadas aos JAs. Inicialmente, foi gerado um banco de dados contendo seqüências das proteínas reguladas por JAs. Tal banco foi usado para o desenvolvimento de uma página da intemet contendo informações sobre a biossíntese e a ação dos JAs na expressão gênica (htto://est.cbmea.unicamp.brliasmonatos). Através da análise deste banco de dados e do "data mining" descobriu-se a presença da via de síntese da durrina, um glicosídeo cianogênico. A análise filogenética das enzimas da via foi realizada, sugerindo a produção da durrina em cana-de-açúcar. Uma análise dos extratos foliares de cana-de-açúcar confirmou a presença do glicosídeo na concentração de aproximadamente 2 ng por grama de peso fresco. Através de experimentos com ferimento foliar observamos que o nível de durrina é relativamente estável, sugerindo uma fina regulação das enzimas de sua síntese e degradação. Para avaliar essa regulação, analisamos a expressão do gene que codifica a enzima a UDP-GLU, que catalisa o último passo metabólico de síntese de durrina, e do gene que codifica a enzima durrinase (DHR) , a qual catalisa sua degradação. em resposta a lagarta (Diatraea sacchara/is) e ao metil-jasmonato (MeJA). Observamos que a concentração dos transcritos das duas enzimas é aumentada após a exposição a esses . estresses. Para obter mais informações sobre a trascrição dos genes que participam da via entre os tecidos/órgãos, utilizamos a técnica de Digital mRNA Expression Profile, sendo que a expressão dos genes UDP-glu e dhr foi confirmada por Northern 810f. Esses resultados permitiram concluir que a durrina ocorre em cana-deaçúcar, possivelmente agindo como uma fitoanticipina (composto pré-formado), associada aos tecidos jovens, e que a via dos JAs pode estar envolvida em sua regulação. Em conjunto, nossos resultados ampliam o conhecimento sobre a atuação dos JAs em plantas

Resumo: Os processos associados ao acúmulo de sacarose e o metabolismo envolvido durante o crescimento e a maturação da cana-de-açúcar tem sido objeto de estudo intensivo. Uma estratégia para associar expressão gênica com uma característica desejada é comparar o perfil de expressão entre indivíduos pertencentes a uma população segregante para aquela determinada característica. Essa estratégia, denominada 'genetical genomics¿ foi utilizada nesse presente trabalho ao avaliar o perfil de expressão gênica de uma população de cana-de-açúcar que segrega para teor de sacarose. Para tal nós utilizamos cDNA microarrays que contém 1,280 elementos envolvidos em transdução de sinal, transcrição, desenvolvimento, ciclo celular, resposta à estresse e interação com patógenos, designado chip SUCAST (Sugarcane Signal Transduction). Com o objetivo de desvendar o envolvimento desses elementos no metabolismo de sacarose, foram comparados os perfis de expressão entre amostras de indivíduos de cana-de-açúcar de uma população segregante para teor de sacarose. Foram analisadas amostras de folha madura, sendo que 24 genes foram identificados como diferencialmente expressos. Também foram analisadas amostras de entrenós em desenvolvimento, sendo que 88 genes foram identificados como diferencialmente expressos em pelo menos uma amostra de entrenó analisada. Dada a complexidade genética da cana-de-açúcar, esta estratégia nos permitiu identificar genes candidatos que podem controlar vias metabólicas sinalizadas por açúcar envolvida na síntese e acúmulo de sacarose em cana-de-açúcar. E finalmente, no trabalho descrito no capítulo 4 nós procuramos por genes codificantes para proteínas tranportadoras de açúcar no banco de dados do SUCEST. A análise de seus diferentes padrões de expressão observado nesse trabalho sugerem seu possível envolvimento tanto em tecidos fonte quanto dreno, e também em diferentes estágios de desenvolvimento

Resumo: O Crescimento e desenvolvimento de todos os organismos dependem de uma regulação adequada da expressão gênica. A expressão gênica diferencial resulta do controle da taxa de iniciação da transcrição por fatores de transcrição. Os fatores de transcrição do tipo bZIP foram descritos em todos os eucariotos. Seu domínio conservado é constituído de uma região rica em aminoácidos básicos que se ligam às bases do DNA, e o zíper de leucinas, responsável pela dimerização. Análises genéticas, moleculares e bioquímicas indicam que os bZIPs são importante reguladores de processos específicos de angiospermas. A identificação de possíveis grupos de genes ortólogos (PoGOs) a partir de diferentes linhagens evolutivas permite racionalizar estudos funcionais. Dentro deste contexto, o presente trabalho visa um melhor conhecimento sobre a evolução e função dos fatores de transcrição do tipo bZIP em angiospermas. Identificamos um conjunto não redundante de 77 bZIPs no genoma de Arabidopsis e 113 no genoma de Oryza sativa. Análises filogenéticas entre o conjunto de Oryza e Arabidopsis permitiram identificar 11 grupos de genes homólogos. Análises mais detalhadas levaram à identificação de 33 PoGOs, que possivelmente representam 33 funções ancestrais de angiospermas, além de um PoGO exclusivo a monocotiledôneas e um possível grupo de parálogos exclusivo a Arabidopsis. Baseado no conjunto de resultados apresentado, propomos uma classificação atualizada das bZIP de angiospermas e um modelo evolutivo das mesmas. Esta abordagem está abrindo novas perspectivas para o estudo funcional de bZIPs. Ensaios de expressão transiente de fusões traducionais de AtbZIP76 e AtbZIP78 com RFP em células de cebola mostram que estes bZIPs são direcionados ao núcleo, apesar de possuírem um domínio básico defectivo

Resumo: O café é um dos principais produtos agrícolas mundiais. O Brasil é um dos maiores países produtores e consumidores de café. Assim sendo, a cafeicultura possui extrema importância econômica em nosso país. Um dos principais fatores que causam prejuízo à lavoura do café é o ataque do bicho mineiro (Leucoptera coffeella), pois Coffea arabica, principal espécie cultivada do café, é suscetível a essa praga. O Instituto Agronômico de Campinas (IAC) empreende um projeto de melhoramento de Coffea arabica, visando a resistência ao bicho mineiro, através de cruzamentos com C. racemosa, espécie naturalmente resistente a L. coffeella.Neste trabalho isolamos genes diferencialmente expressos durante o ataque do bicho mineiro a plantas de uma progênie híbrida derivada de cruzamentos entre Coffea arabica e C. racemosa. Foram construídos macroarranjos de DNA contendo 1536 ESTs de bibliotecas de subtração enriquecidas em genes preferencialmente expressos em plantas resistentes infestadas. Membranas foram hibridadas com sondas de cDNA obtidas a partir de RNA total de folhas suscetíveis e resistentes ao bicho mineiro, em diferentes momentos da infestação (controle não infestado, pósoviposição e pós-eclosão). Após análises estatísticas e clusterização hierárquica, 21 cDNAs induzidos em pelo menos um tratamento foram selecionados como diferencialmente expressos durante a infestação do bicho mineiro. A expressão diferencial de cinco genes (PR-8, CAX9, SPC25, psaH, BEL) foi confirmada através de RNA blot contendo RNA de um segundo experimento de infestação, demonstrando a eficiência dos macroarranjos de DNA na seleção de genes diferencialmente expressos. O padrão de expressão dos cinco genes citados foi verificado em diferentes órgãos do cafeeiro e durante o desenvolvimento do fruto do café. Nossos resultados sugerem que o mecanismo de resistência ao bicho mineiro é derivado de uma maior expressão basal de genes relacionados a defesa em plantas resistentes do que em plantas suscetíveis, e que plantas resistentes possuem um mecanismo de sinalização de defesa disparado pela oviposição de L. coffeella. Dentre os cDNAs selecionados, destacamos SSH101B04, cuja proteína deduzida é similar a inibidores de protease do tipo Kunitz STI (Soybean Trypsin Inhibitor). Devido a sua alta similaridade com proteínas do tipo miraculina, esse gene foi denominado CoMir (Coffea Miraculin). CoMir foi induzido após a oviposição em plantas resistentes, mas não foi induzido após a eclosão da lagarta do minador em plantas resistentes nem em plantas suscetíveis. Através de ensaios de RNA blot foi verificado que CoMir é expresso em folhas, botões florais verdes e brancos e em frutos verdes imaturos. Ensaios de hibridação in situ demonstraram que CoMir é expresso no metaxilema de folhas, de pétalas e do estigma, e no estômio, endotécio, tapete e feixe vascular da antera. Ensaios de localização subcelular demonstraram que a proteína CoMir localizou-se preferencialmente no apoplasma e no citoplasma de células de epiderme de cebola (Allium cepa). Nossos resultados sugerem que CoMir é uma proteína reguladora de proteólise durante o desenvolvimento do café, que é mobilizada para defesa após a oviposição de L. coffeella

Resumo: A análise do banco de ESTs de endosperma de milho (MAIZEST) revelou que o gene da sorbitol desidrogenase (SDH) é o transcrito mais abundante no início do desenvolvimento da semente (aos 10 dias após a polinização - DAP). A SDH cataliza a redução NADH-dependente da frutose em sorbitol ou a oxidação do sorbitol em frutose. Em Rosaceae esta enzima tem um importante papel na translocação do sorbitol das folhas para os frutos e no armazenamento da frutose nos frutos. A semente de milho, todavia, não acumula frutose nem sorbitol, que portanto, deve ser um metabólito intermediário. A atividade bioquímica da SDH de milho já havia sido caracterizada, porém não havia informações sobre sua estrutura genômica. Visando estudar o gene da SDH, a seqüência genômica completa foi seqüenciada. A região codificante da SDH mostrou-se muito conservada, o que não ocorre com as regiões não codificantes. Inclusive, ocorrendo uma perda de introns entre as diferentes espécies de plantas. Análises de Southem blot e isoenzima indicaram que há apenas um loeus de SDH em milho. As análises de Northem blot e atividade enzimática confirmaram que a expressão está restrita ao endosperma, e que começa logo após a polinização, I atingindo o ápice aos 15 DAP e caindo a níveis baixos aos 25 DAP. A localização enzimática in situ mostrou que a atividade está restrita ao endosperma amiláceo, mais especificamente na região basal da semente, próxima ao embrião. Os mutantes sugary1 e shrunken2, que acumulam mais açúcares, têm uma maior atividade de SDH. A injeção de até 150 mM de sacarose na semente de milho causou um aumento de atividade de SDH, confirmando os resultados obtidos com os mutantes. Esse aumento parece ser ao nível transcricional e ser regulado pelo intron 1. O intron 1 parece controlar não apenas à reposta a sacarose, mas também a resposta à hipoxia. O papel do sorbitol e da SDH nas sementes de milho em desenvolvimento parece ser crucial, porém permanece indefinido. O sorbitol é encontrado nos embriões de milho, apesar de não ter sido encontrada atividade da SDH. Além disso, foi demonstrado que os embriões conseguem se desenvolver tendo como única fonte de carbono o sorbitol. Foram encontrados ESTs no MAIZEST de um transportador de sorbitol no endosperma e de aldose redutase (AR), capaz de converter sorbitol em glicose, no embrião. Foi mostrado também que o sorbitol pode ser transportado do endosperma para o embrião. Desta forma, podemos sugerir a partir dos resultados que o sorbitol pode ser translocado do endosperma para o embrião pelo transportador de sorbitol e ser convertido em glicose pela AR no interior do embrião. Nossos resultados indicam que o sorbitol pode atuar de três maneiras; primeiro como um açúcar que é transportado de modo não vascular do endosperma para o embrião; segundo, como um metabólito intermediário; e terceiro, servindo como um escape para o excesso de NAD(P)H formado no interior hipóxico da semente. Os resultados apresentados nesta tese mostram um mecanismo inédito de interação metabólica entre o embrião e o endosperma, mediado pelo sorbitol, cuja síntese na semente, até então, era tida como um caminho "sem saída"

Resumo: Solos ácidos são encontrados em todas as regiões do planeta e em grandes proporções nas regiões tropicais e subtropicais. Como conseqüência da acidez do solo, o alumínio (Al), metal mais abundante da crosta terrestre, torna-se solúvel e atinge concentrações tóxicas para a maioria das espécies de plantas cultivadas. O primeiro dano provocado pelo Al iônico é a redução do desenvolvimento radicular, causando distúrbios fisiológicos que acarretam na redução da produção. Devido às limitações dos métodos convencionais de correção do pH do solo e a necessidade de longos períodos de tempo para o desenvolvimento de novas cultivares pelo melhoramento genético clássico, muita ênfase tem sido dada para a compreensão dos mecanismos de toxidez e de tolerância ao Al em plantas. Pois, com a aquisição destes conhecimentos, espera-se mais sucesso na obtenção de plantas tolerantes ao Al com o emprego da tecnologia de DNA recombinante e da seleção assistida por marcadores moleculares. Neste trabalho utilizamos duas linhagens de milho contrastantes para tolerância ao Al: Cat100-6 (tolerante ao Al) e S1587-17 (sensível ao Al), com o objetivo de estudar as alterações na expressão gênica promovidas pelo estresse de Al no ápice radicular. A presente tese esta dividida em três linhas de pesquisa: i) identificação, clonagem e caracterização de um gene codificando uma enzima glutationa S-transferase e avaliação dos efeitos do Al na sua expressão gênica; ii) avaliação das alterações na expressão gênica em ápices de raízes de duas linhagens de milho quando submetidos ao estresse de Al, utilizando um sistema de hibridização heterólogo com ESTs (expressed sequence tags) de cana-de-açúcar; e iii) clonagem e caracterização em milho do gene ALMT1, pertencente a uma nova classe de proteína transportadora de moléculas orgânicas especificamente ativada pelo Al. No trabalho com o gene GST27.2 observamos que este gene foi induzido pelo estresse provocado por Al e por Cd (cadmio) e que mutações que provocavam alterações na composição de aminoácidos da proteína poderiam promover alterações vi na atividade e na especificidade desta enzima. Além disso, o gene GST27.2 parece ser um novo alelo do gene GST27 estando presente como cópia única no genoma das linhagens de milho estudadas. Já no trabalho de avaliação da expressão gênica em larga escala, foram identificados 85 genes nos ápices radiculares das duas linhagens de milho cuja expressão foi diferencialmente alterada pela presença do Al. Embora alguns dos genes já tivessem sido descritos como responsivos ao Al, para a maior parte dos genes identificados neste trabalho, este foi o primeiro relato descrevendo seu envolvimento com o estresse de Al. A clonagem em milho do gene homológo ao gene ALMT1, demonstrou que o milho também deve ter uma proteína de membrana presente em células do ápice radicular que pode estar envolvida com transporte de moléculas orgânicas. Embora a proteína não esteja envolvida com o transporte de malato, a mesma teve sua atividade melhorada pela presença do Al. Entretanto, o gene que codifica esta proteína é reprimido no tecido do ápice radicular das linhagens de milho tolerante e sensível ao Al, o que pode indicar a existência de regulação pós-transcricional. Os resultados obtidos a partir destas três abordagens contribuíram para a compreensão dos mecanismos de tolerância e toxidez ao Al em raízes de milho. Futuramente, essas informações auxiliarão na escolha de genes mais apropriados para a criação de plantas geneticamente alteradas mais adaptadas a presença do Al no solo

Resumo: O locus Opaco-2 codifica um fator de regulação da transcrição do tipo bZIP que atua no controle coordenado do metabolismo do carbono, nitrogênio e da síntese das prolaminas de reserva durante o desenvolvimento da semente de milho. Prováveis proteínas ortólogas e várias bZIPs similares a OPACO-2 foram identificadas e parcialmente caracterizadas em outras monocotiledôneas. A análise filogenética de um grupo e não redundante de bZIPs de plantas, incluindo os quatros genes de A. thaliana, Bzo2h1, Bzo2h2, Bzo2h3 e Bzo2h4, permitiu identificar um grupo de 20 proteínas homólogas à proteína O2, denominada de família O2. Bzo2h2 é um gene único que provavelmente representa uma função comum a monocotiledôneas e dicotiledôneas. Genes quiméricos a fim de promover o silenciamento gênico ou a superexpressão de Bzo2h2, assim como fusões traducionais da seqüência promotora desse gene com o gene marcador gusA foram introduzidos em A. thaliana. Um mutante nulo para Bzo2h2 também foi obtido a partir de um banco de mutantes de inserção de T-DNA. Bzo2h2 encontra-se expresso nos feixes vasculares, mais especificamente no floema de cotilédones, folhas, hipocótilo, raízes, flores e vagens. A localização in situ da presença do mRNA para Bzo2h2 através da técnica de hibridação in situ permitiu confirmar os resultados obtidos através da avaliação da atividade de GUS. Uma análise detalhada do padrão de expressão de Bzo2h2 ao longo do desenvolvimento revelou que a atividade de GUS já se encontra presente no procâmbio no estágio de maturação do embrião, indicando que mesmo antes de haver a diferenciação de xilema e floema, o gene Bzo2h2 já se encontra expresso, caracterizando assim um marcador de diferenciação do floema. A expressão específica de Bzo2h2 no floema sugere um possível envolvimento deste gene em algum aspecto da diferenciação deste tecido, já que ele se encontra expresso no procâmbio e no ápice de raízes, regiões onde o xilema e o floema ainda não se diferenciaram. Entretanto, análises histológicas da anatomia do feixe vascular de plantas superexpressando Bzo2h2 e do mutante nulo bzo2h2-1 não revelaram diferenças na organização e na estrutura do tecido vascular em relação a plantas selvagens. A ausência de fenótipo diferencial nas plantas silenciando Bzo2h2 e no mutante nulo bzo2h2-1 pode estar relacionada com o fato de que as condições testadas não permitiram evidenciar o processo no qual Bzo2h2 está envolvido, ou que as modificações são sutis e consequentemente de difícil percepção, ou ainda que algum grau de redundância funcional pode estar mascarando os efeitos das mutações em Bzo2h2. Juntos, os resultados levam à identificação de um gene que se mantém expresso ao longo de praticamente todos os estágios do desenvolvimento, exceto nos primeiros estágios embrionários, em todos os órgãos; e que parece não responder aos principais reguladores do crescimento e desenvolvimento, como fitohormônios, açúcares e estresses abióticos, como estresse osmótico, ausência de luz e baixa temperatura

Resumo: Os fatores de transcrição bZIP ligam-se como dímeros a seqüências de DNA específicas presentes nas regiões promotoras, atuando como moduladores da expressão de vários genes em eucariotos. O conjunto completo e não redundante dos fatores de transcrição bZIP de Arabidopsis thaliana foi agrupado em 13 sub-famílias filogenéticas. Essa classificação permitiu organizar 85 clusters de cana-de-açúcar que codificam bZIPs, obtidos no projeto SUCEST. As sub-famílias IV e XIII de A. thaliana não foram encontradas em cana de açúcar, provavelmente devido ao baixo nível de expressão destas sub-famílias em cana-de-açúcar. As análises filogenéticas com as bZIPs da sub-família Opaco2 suportam um modelo de evolução que envolve a duplicação de dois genes homólogos antes da separação das monocotiledôneas e dicotiledôneas. Expansões posteriores resultaram em três duplicações gênicas nas monocotiledôneas e uma nas plantas dicotiledôneas. Assim, a proteína Opaco2 provavelmente é o resultado de uma duplicação específica das plantas monocotiledoneas e representa uma especialização restrita a essas plantas. Uma proteína bZIP de cana-de-açúcar, SCbZIP I, foi clonada e caracterizada bioquimicamente. Ensaios de mobilidade eletroforética mostraram que a proteína SCbZIP I liga-se fortemente a sondas de DNA do tipo G-box, C-box e Hex. A fosforilação por CKII reduz sua afinidade pelo DNA. SCbZIP I foi capaz de produzir homodímeros e também heterodímeros com duas formas truncadas de Opac02. O gene é ativo nos estágios iniciais do desenvolvimento de plântulas, sendo expresso nas gemas laterais e também nas flores. o perfil de expressão dos 85 genes que codificam as bZIPs de cana-de-açúcar foi avaliado com maCrOaITanjos de DNA. Sete genes foram diferencialmente expressos durante o desenvolvimento de plântulas e outros oito foram modulados pelos hormônios ácido abscísico ou metil jasmonato

Resumo: A lisina é um aminoácido essencial, sintetizada em plantas através da via metabólica do ácido aspártico. O catabolismo da lisina é desempenhado pela ação de duas enzimas consecutivas, lisina 2-oxoglutarato redutase (LOR) e sacaropina desidrogenase (SDH). A concentração final de lisina solúvel em sementes de cereais é controlada tanto pela taxa de biossíntese quanto de catabolismo, porém, o catabolismo desempenha um papel central neste controle. O entendimento dos aspectos regulatórios das vias metabólicas de biossíntese e degradação da lisina, bem como a manipulação das enzimas relacionadas são importantes para a produção e caracterização de plantas com alta concentração de lisina, principalmente que acumulem lisina nas sementes. Neste trabalho foi isolada, purificada parcialmente e caracterizada a LOR e SDH de sorgo. Estes procedimentos foram particularmente trabalhosos devido a instabilidade e atividades muito baixas das enzimas, embora diversos métodos de purificação e modificações nos tampões tenham sido testados. Um pico principal de atividade para LOR e SDH foi observado e co-purificado após precipitação com sulfato de amônio e cromatografia de troca iônica, sugerindo a existência de um polipeptídeo bifuncional contendo dois domínios, conforme previamente observado para LOR e SDH em outras espécies de plantas estudadas. As análises da concentração de lisina em sementes sugerem que o sorgo naturalmente contém concentrações de lisina elevadas, quando comparado a outros cereais, o que pode ser explicado pelas baixas atividades de LOR e SDH observadas, de maneira similar a outras plantas que acumulam lisina já estudadas. Devido a estas altas concentrações de lisina, estudos futuros podem ser desenvolvidos para melhor caracterizar o sorgo como uma fonte alimentar rica no conteúdo do aminoácido essencial lisina, entre outros

Resumo: Conhecer a variabilidade genética de plantas de interesse econômico permite manipular recursos naturais de forma eficiente, visando o melhoramento vegetal. A milho é uma das mais importantes plantas cultivadas e a diversidade que o germoplasma tropical apresenta ainda não está bem estabelecida. Atualmente, os marcadores moleculares são a principal maneira de analisar essa diversidade, e muitas possibilidades estatísticas foram desenvolvidas para organizar informações de dados moleculares. Este trabalho usou os marcadores AFLP e SSR para avaliar a diversidade genética em linhagens de milho tropical pertencentes ao Banco de Germoplasma do Instituto Agronômico de Campinas (IAC), e revelou grande nível de variabilidade. Os três tipos de coeficiente usados (Jaccard, MRD e coeficiente de parentesco molecular) exibiram baixos valores de similaridade entre as linhagens e, dependendo do marcador usado, diferentes agrupamentos foram obtidos. Entretanto, altas correlações entre as matrizes geradas por Jaccard e pelo coeficiente de parentesco molecular com AFLP, SSR e AFLP/SSR foram observadas. As correlações entre AFLP e SSR foram baixas, independentemente do coeficiente de similaridade aplicado. Devido à habilidade dos SSRs em revelar vários aspectos da variação genômica, essa técnica foi considerada mais apropriada para análises de diversidade. Notou-se que a grande diversidade existente no material tropical levou a resultados distintos se marcadores diferentes foram usados, e que o uso simultâneo de AFLPs e SSRs pode não ser a maneira mais eficiente de avaliar a variabilidade em materiais altamente divergentes

Resumo: Estresses ambientais representam um dos principais fatores limitantes para a produtividade agrícola. Sendo assim, fazem-se importantes estudos que têm por objetivo analisar ao nível molecular os efeitos causados por esses estresses. Neste trabalho, analisamos o perfil de expressão gênica em plântulas de cana-de-açúcar submetidas a baixas temperaturas. Inicialmente, membranas de alta densidade (DNA macroarrays) contendo 1536 ESTs (Etiquetas de Seqüências Expressas) do projeto SUCEST (Sugarcane EST Project) foram hibridadas com sondas de cDNAs obtidas a partir de RNA total de tecido foliar de plântulas de cana-de-açúcar crescidas in vitro e submetidas a 4 oC por 3, 6, 12, 24 e 48 h. Como controle, foram utilizadas plântulas in vitro crescidas a 26 oC. O experimento foi repetido duas vezes, utilizando-se RNA total de novas plântulas tratadas e controle. Somente ESTs que apresentaram padrão de indução ou repressão semelhantes nos dois experimentos foram considerados para posterior análise. Desta forma, os resultados permitiram a identificação de 59 ESTs que foram induzidos ou reprimidos pelo estresse abiótico, dentre os quais alguns ESTs sem homólogos no GenBank. Alguns genes selecionados tiveram seu perfil de expressão confirmado por RNA-blot. Utilizando o banco de dados do SUCEST e seqüências de proteínas oriundas do NCBI, foi gerado um banco de dados contendo 33 proteínas de cana-de-açúcar relacionadas ao frio. Dentre essas proteínas foi identificada proteína similar a PUMP (Plant Uncoupling Mitochondrial Protein), a qual está envolvida em mecanismos de redução da produção de espécies reativas de oxigênio durante estresses abióticos. Posteriormente, quatro outras proteínas pertencentes à família PUMP foram identificadas no banco de dados do SUCEST, além de quatro proteínas pertencentes à família AOx (alternative oxidase). Análises filogenéticas corroboraram a hipótese da existência de novos membros de ambas as famílias de proteínas em cana-de-açúcar (Saccharum sp. PUMPs e AOxs, ou seja, SsPUMPs e SsAOxs, respectivamente) e em Arabidopsis (AtPUMPs e AtAOxs). Análise do perfil de expressão desses genes sugere que PUMPs e AOxs são expressos em órgãos diferentes em cana-de-açúcar e em Arabidopsis. Adicionalmente, resultados de RNA-blot sugeriram que dois membros da família de PUMPs (SsPUMP4 e SsPUMP5) e um membro da família AOx (SsAOx1c) foram induzidos por baixa temperatura (4 oC), enquanto que, em Arabidopsis, dois membros da família PUMP (AtPUMP4 e AtPUMP5) e um membro da família AOx (AtAOx1a) foram também induzidos pelo estresse abiótico, entretanto, com perfis diferentes. Interessantemente, o gene AtAOx1d foi reprimido após exposição das plantas a baixas temperaturas. Análises in silico demonstraram a existência de 26 membros da superfamília de proteínas NAC em cana-de-açúcar, incluindo um gene identificado em estudos de expressão gênica, denominado SsNAC23 (Saccharum sp. NAC23). Este gene foi completamente seqüenciado e posteriormente analisado. Resultados de RNA-blot sugerem que o gene SsNAC23 é regulado por baixa temperatura (4 oC), mas não por 12 °C, além de herbivoria (Diatraea saccharalis) e estresse hídrico (Polietilenoglicol, PEG 6000, 20%). Ensaios de localização subcelular demonstraram que a proteína SsNAC23 localizou-se preferencialmente no núcleo de células epidérmicas de cebola (Allium cepa). A construção de um modelo molecular do domínio NAC da proteína SsNAC23 permitiu a análise de determinantes estruturais possivelmente envolvidos em ligação a DNA, sugerindo seu papel como fator de transcrição. Alinhamento desses determinantes de outras proteínas contendo domínio NAC revelou alta conservação de importantes aminoácidos envolvidos no contato entre proteína e molécula de DNA. Em conjunto, nossos resultados sugerem que a proteína SsNAC23 é um fator de transcrição envolvido em mecanismos de resposta a estresses bióticos e abióticos

Resumo: Com o objetivo de identificar e clonar um gene novo do DNA mitocondrial (DNAmt) de Coix lacryma-jobi L. (coix), utilizou-se a estratégia da hibridização heteróloga. Para tanto amplificou-se por PCR um fragmento correspondente a um quadro de leitura aberto ("open reading frame"-oif), denominado orf167, presente no DNAmt da briófita Marchantia polymorpha, e tido como um possível gene. Marcou-se radioativamente e utilizou-se esta sequência como sonda em hibridizações com o DNAmt de coix digerido com várias enzimas. Identificou-se um fragmento homólogo Bgl II/ Bgl II de 1,4 kb, o qual foi clonado em pBluescript. Elaborou-se o mapa de restrição deste fragmento e localizou-se nele a exata região de homologia com a orf167. A região de homologia estava presente em um fragmento interno de 0,5 kb Spe I / Pvu II. Este fragmento de 0,5 kb, homólogo à orf167, foi utilizado em hibridizações com o DNArmt de várias espécies de plantas superiores (alfafa, batata, coix, couve-flor, ervilha, milho e soja), verificando-se que o mesmo correspondia a uma seqüência altamente conservada. Este mesmo fragmento foi também hibridizado em membranas contendo o RNAmt tota de oix e de outras espécies de plantas superiores (milho e couve flor). Os resultados revelaram que ele é transcrito na mitocôndria das espécies analisadas. O fragmento original de 1,4 kb Bgl II / Bgl II foi divido em 5 subfragmentos, os quais foram clonados e sequenciados. Após a análise da homologia desta sequência com outras presentes nos bancos de dados, verificou-se que o fragmento de 1,4 kb Bgl II./ Bgl II, isolado do DNAmt de coix, contém um "cluster" gênico onde estão presentes o gene que codifica o tRNA serina (tRNAScr), um pseudo-gene provavelmente originado do tRNA fenilananina (tRNAPhe), os genes nad3 e rps12. Tais genes presentes em coix são muito similares àqueles presentes em trigo e milho, os quais se organizam também em um "c1uster" gênico muito similar ao existente em coix. Estudos de expressão realizados através de "Northern Blotting" e RT ¿PCR mostraram que os genes tRNA ser, nad3 e rps12 são transcritos, sendo os dois últimos cotranscritos. Vinte e três elones de cDNA dos transcritos dos genes nad3 e rps12 foram seqüenciados, e tiveram suas sequências comparadas com a seqüência genômica. Encontrou-se 21 sítios de edição nos transcritos do gene nad3 e 8 sítios nos transcritos do gene rps12. Após comparações entre a sequência de aminoácidos predita a partir do clone genômico e do cDNA, observou-se que todas as edições modificam o aminoácido especificado pelo codon onde O evento de edição foi detectado, tornando a sequência de aminoácidos editada diferente da prevista pela sequência genômica. Vinte sítios de edição no gene nad3, e 6 no gene rps12, alteram a identidade do codon, de modo a especificar um aminoácido mais conservado durante a evolução entre diferentes espécies vegetais. Os outros três sítios, sendo I no gene nad3 e 2 no gene rps12, acarretam mudanças raras, espécie-específicas e não conservativas. Todos os 23 elones de cDNA investigados estavam diferentemente editados, predominando os cDNAs com sítios parcialmente editados. Não foi encontrada nenhuma orientação preferencial (5' para 3', ou 3' para 5') para o processamento da edição. Discute-se os motivos do reconhecimento do gene nad3 de coix pela orf167 de M. polymorpha

Resumo: Sementes de cereais não são boas fontes de aminoácidos essenciais, particularmente lisina e treonina, sintetizados a partir da via metabólica do ácido aspártico. Embora muitas enzimas desta via tenham sido estudadas em várias espécies de plantas superiores, o metabolismo de lisina e treonina ainda é totalmente desconhecido em sorgo. Neste trabalho, foram estudadas duas enzimas, aspartato quinase (AK) e homoserina desidrogenase (HSDH). Condições ótimas de ensaio foram estabeleci das para a determinação das atividades de AK e HSDH. Os maiores níveis de atividade foram observados em sementes imaturas de sorgo, utilizando-se para ambos ensaios 50 _L de amostra e um período de incubação de 10 à 30 min, dependendo da enzima a ser avaliada e da concentração de proteínas da extrato. Particularmente para HSDH, o co-fator mais efetivo para determinação de atividade foi o NADP. Precipitação com sulfato de amônia, cromatografia de troca aniônica e cromatografia de filtração em gel foram os métodos de separação de proteínas utilizados para purificar e identificar as isoenzimas de AK e HSDH de sementes de sorgo. Dois picos de atividade de AK foram eluídos a partir de coluna de troca aniônica (DEAE-Sephacel) com 183 e 262 mmol.L-1 KCl. Os dois picos foram fortemente inibidos por lisina. Com relação à HSDH, dois picos sobrepostos foram eluídos com 145 e 183 mmol.rl KCI, sendo o primeiro pico resistente à inibição por treonina e o segundo sensível à inibição por este aminoácido. Entretanto, através de coluna cromatográfica de filtração em gel (Sephacryl S-200) foi observado um pico de atividade de AK co-eluído juntamente com o pico de HSDH, ambos sensíveis à inibição por treonina, sugerindo a presença de uma isoenzima bifuncional AK-HSDH em sorgo e a massa molecular dessa isoenzima foi estimada em 164 kDa. AAK foi purificada cerca de 30 vezes pelos métodos utilizados. As atividades de AK e HSDH foram estudas na presença de lisina, treonina, metionina, valina, cálcio, EOTA, calmodulina, SAM, AEC e concentrações crescentes de KCl. A AK foi inibida por treonina e lisina, confirmando a existência de duas isoenzimas, uma sensível à inibição por treonina e outra à inibição por lisina, sendo esta última predominante em sementes de sorgo. Metionina, SAM + lisina e AEC, também inibiram a atividade de AK, entretanto, KCI e cálcio também não promoveram alterações na atividade desta enzima, confirmando que a AK de sorgo não é regulada por cálcio. HSDH foi inibida por treonina indicando a existência de uma HSDH sensível à treonina, porém, a maior parte da atividade não foi inibida por treonina, confirmando a existência de uma segunda HSDH quantitativamente predominante, resistente à inibição por treonina. Valina e SAM + treonina também inibiram a atividade de HSDH enquanto que KCI e cálcio não promoveram nenhuma alteração na atividade da enzima. Com relação às proteínas de reserva de sorgo presentes nas sementes do híbrido comercial MASSA 03, foi observada alta concentração de glutelinas e baixa concentração de kafirinas, equivalentes às concentrações encontradas nos mutantes alta lisina. Semelhantemente, em relação aos aminoácidos solúveis, o sorgo MASSA 03, também apresentou concentrações compatíveis às dos genótipos mutantes alta lisina, sugerindo que este híbrido comercial também apresenta característica de alta lisina. Entretanto, para programas de melhoramento, o genótipo de sorgo mais viável seria o mutante IS 16227, devido a seu alto desempenho no que diz respeito às proteínas de reserva e aminoácidos solúveis

Resumo: A maior parte dos caracteres de importância agronômica e econômica do milho estão sob o controle de diversos locos gênicos, denominados locos de caracteres quantitativos (QTL). A possibilidade do uso de marcadores moleculares e o aperfeiçoamento dos modelos estatístico-genéticos possibilitaram o mapeamento desses locos gênicos que afetam tais caracteres. Pouco enfoque no estudo de mapeamento de QTL foi dado em populações derivadas do germoplasma do milho tropical, o qual possui uma base genética ampla com maior diversidade do que o germoplasma temperado. Da mesma forma, pouco se conhece sobre as interações dos QTL nos diferentes ambientes (QTL X E). Duzentos e cinqüenta e seis progênies F2:3, derivadas do cruzamento de duas linhagens de milho tropical, foram avaliadas em cinco ambientes. O mapa genético foi desenvolvido com 139 marcadores microssatélites, utilizando o programa MAPMAKER/EXP versão 3.0b. As análises de mapeamento de QTL e a detecção da interação QTL X E foram realizadas utilizando o procedimento JZmapQTL do programa Windows QTL-Cartographer versão 2.5, que se baseia na análise de mapeamento em ambientes múltiplos (mCIM). A extensão total do mapa genético foi de 1.858,61 cM com intervalo médio entre marcadores de 13,47 cM. Dezesseis QTL foram mapeados para produção de grãos, oito para espiga por planta, seis para acamamento, seis para altura de planta, nove para altura de espiga e dois para número de folhas. Os efeitos genéticos dos QTL mapeados apresentaram variação em sinal e magnitude, demonstrando que cada QTL contribui de forma particular para a expressão dos caracteres. A maioria destes QTL apresentou ação gênica sobredominante, e muitos deles também apresentaram significante interação QTL X E. Esses resultados forneceram dados para uma melhor compreensão da arquitetura genética do genoma do milho tropical. Estas informações podem ser utilizadas em programas de seleção assistida dessa espécie, utilizando marcadores moleculares, gerando mais eficiência nos programas brasileiros de melhoramento

Resumo: A produção de grãos e outros caracteres de importância econômica para a cultura do milho, tais como a altura da planta, o comprimento e o diâmetro da espiga, apresentam herança poligênica, o que dificulta a obtenção de informações sobre as bases genéticas envolvidas na variação desses caracteres. Este trabalho foi realizado para mapear QTL's associados à produção de grãos, a componentes da produção e a caracteres morfológicos. Para isso, foram utilizadas duas populações F2, (OL e PR), originadas a partir do cruzamento de linhagens tropicais obtidas das populações IG-1, IG-2 e BR-106. Para a população OL, composta de 404 plantas, foram empregados 75 marcadores do tipo microssatélite na construção de um mapa de ligação com 1.437 cM de extensão e 19,16 cM de intervalo médio entre marcas. Para a população PR, composta de 446 plantas, o mapa de ligação de 1.658 cM de extensão e de 14,17 cM de intervalo médio entre marcas foi obtido pelo emprego de 117 marcadores do tipo microssatélite. Em ambas populações, foram mensurados os caracteres produção de grãos, altura da planta, altura da espiga, número de folhas acima da espiga superior, número de ramificações do pendão, comprimento e diâmetro da espiga, número de fileiras de grãos por espiga e número de grãos por fileira por espiga. O número e distribuição genômica dos QTL's, bem como o tipo e magnitude de seus efeitos foram determinados pela utilização do método de mapeamento por intervalo composto. Para a população OL, foram mapeados cinco QTL's para produção de grãos, distribuídos nos cromossomos 2, 5, 7 e 8. A porcentagem da variância fenotípica explicada por cada QTL variou de 4,12% a 7,59% e os tipos de ação gênica predominante foram dominância e dominância parcial. Para a população PR, foi mapeado apenas um QTL para produção de grãos, localizado no cromossomo 2. Tal QTL apresentou ação gênica do tipo dominância parcial e explicou 5,15% da variação fenotípica. Dos 27 QTL's detectados para a população OL, sete foram localizados no cromossomo 3, sete no cromossomo 5 e quatro no cromossomo 7, representando 67% do total de QTL's mapeados em todo o genoma para essa população. Para a população PR, dos 35 QTL's detectados, quatro foram mapeados no cromossomo 1, seis no cromossomo 2, três no cromossomo 3, seis no cromossomo 5, dois no cromossomo 7, quatro do cromossomo 8, dois no cromossomo 9 e dois no cromossomo 10, representando 83% do total de QTL's mapeados em todo o genoma. Embora tenha havido a formação de blocos de QTL's nas duas populações, somente as observações do tamanho de cada intervalo e das correlações fenotípicas dos caracteres envolvidos não permitem concluir se essas regiões genômicas contém QTL's ligados e/ou QTL's com efeitos pleiotrópicos

Resumo: A leprose dos citros e a mancha marrom de Alternária são importantes doenças da citricultura. O conhecimento dos mecanismos genéticos envolvidos nas resistências apresentadas por algumas espécies e híbridos de citros a estas doenças é de fundamental importância para o desenvolvimento de estratégias para o melhoramento genético visando à utilização de resistência varietal. Neste aspecto, este trabalho teve como objetivo principal estudar a herança genética das resistências dos citros à leprose e à mancha marrom de Alternária, baseando-se em mapeamento genético e localização de QTL (quantitative traits loci) e análise de genes diferencialmente expressos para leprose através da técnica de hibridação subtrativa por supressão (SSH). Uma população de 143 híbridos interespecíficos, obtidos do cruzamento dirigido entre as variedades tangor 'Murcott¿ [Citrus reticulata (L.) Blanco x C. sinensis (L.) Osbeck], resistente à leprose e suscetível à mancha marrom de Alternária e laranja 'Pêra¿ (C. sinensis (L.) Osb.), suscetível à leprose e resistente à mancha marrom, juntamente com seus parentais, foi estabelecida em campo e avaliada quanto à leprose e Alternária por três anos. As plantas foram inoculadas com o vírus da leprose dos citros, tipo citoplasmático (CiLV-C) pelo seu vetor, o ácaro Brevipalpus phoenicis (Geijskes, 1939) (Acari: Tenuipalpidae) e naturalmente infestadas pelo fungo Alternaria alternata patotipo tangerina, agente causal da mancha marrom de Alternária. As plantas foram genotipadas com marcadores AFLP (amplified fragment length polymorphism) e RAPD (random amplified polymorphic DNA). Foi realizado um estudo de diversidade genética entre os híbridos por marcadores moleculares através do aplicativo NTSYS v.2.0. Variáveis de incidência e severidade para leprose e de crescimento vegetativo (altura de planta e diâmetro de tronco) mostraram valores altos de herdabilidade no terceiro ano de avaliação (0,88 a 0,96) para as características de incidência e severidade da doença e intermediários para os parâmetros relacionados com crescimento (diâmetro de tronco e altura de planta) (0,64 e 0,68). A variável ¿número de ponteiros afetados¿ foi avaliada por dois anos para a mancha marrom de Alternária. Mapas genéticos para cada parental e um mapa integrado foram obtidos, respectivamente, através dos aplicativos Mapmaker v.2.0 e JoinMap 3.0. As análises de QTLs foram realizadas pelo aplicativo MAPQTL v.4.0 no mapa integrado, sendo localizados um QTL consistente para as características de incidência e severidade avaliadas para leprose e um QTL para a característica ¿número de ponteiros afetados¿ para a mancha marrom de Alternária. As análises das seqüências diferencialmente expressas, em condições de inoculação do CiLVC pelo seu vetor, através da técnica SSH, permitiram identificar um grande número de genes se expressando no parental resistente tangor 'Murcott¿ e envolvidos em diversos processos relacionados à resistência a fitopatógenos como: resposta a estresses oxidativos, percepção e transdução de sinal, degradação controlada de proteínas e síntese de proteínas relacionadas à patogenicidade. Os resultados obtidos sugerem uma grande diversidade genética dentro da progênie avaliada e que as doenças leprose e mancha marrom de Alternária possivelmente são controladas por poucos genes. Esse é o primeiro trabalho que aborda estudos da herança genética da resistência à leprose e de genes expressos em resposta de plantas de citros ao CiLV-C

Resumo: A presença de metais pesados no ambiente é atualmente, um dos principais problemas de contaminação ambiental, uma vez que, os metais liberados no ambiente contaminam o solo e entram na cadeia alimentar através das plantas, causando efeitos tóxicos a curto e a longo prazo aos animais e seres humanos. No caso do metal pesado Níquel (Ni), foi constatado que a sua presença nas plantas pode diminuir o crescimento, reduzir a taxa de fotossíntese e provocar alterações, tanto nas atividades enzimáticas quanto metabólicas.Pouca informação está disponível na literatura, com referência a resposta antioxidante das plantas à expressão a esse metal. Neste sentido, os objetivos deste trabalho foram realizar diferentes ensaios para avaliar o efeito fitotóxico do Ni em plântulas de C. juncea. Neste estudo foram analisados parâmetros bioquímicos relativos à atividade das enzimas antioxidantes, Catalase (CAT), Superóxido Dismutase (SOD) e Glutationa Redutase (GR). Constatou-se que, não houve alteração da atividade GR e CAT nas raízes. Entretanto, atividades destas enzimas apresentaram aumento significativo na parte aérea. O aumento na atividade da GR, na parte aérea, pode ser explicado pelo fato de ser o ciclo Halliwell-Asada o principal mecanismo que age na desintoxicação de Espécies Ativas de Oxigênio. Quanto à atividade da SOD, quando comparados ambos tecidos, foi constatado que na parte aérea foi pouco alterada, entretanto, a atividade da SOD foi estimulada nas raízes na presença do Ni. Para aumentar a precisão dos resultados, quantificou-se pela técnica de Fluorescência de Raios X, a concentração de NiCl2 e o seu efeito na absorção de nutrientes nas plântulas de crotalaria. Nesta análise, observou-se o acúmulo do metal nas raízes e baixa translocação para a parte aérea. Também foi analisada a concentração de Malonaldeído (MDA) na parte aérea de plântulas de C. juncea, sendo constatada, a ocorrência de peroxidação lipídica na presença do Ni. Finalmente, determinou-se o efeito do Ni sobre as concentrações de aminoácidos solúveis em raízes e na parte aérea, como estratégia desta planta para superar o efeito do Ni , não tendo sido observadas variações significativas nas concentrações dos mesmos com os diferentes tratamentos com Ni. Palavra¿Chave: Aminoácidos, Atividade Enzimática, Crotalária, Fitotoxicidade, Níquel, Poluição Ambiental

Resumo: Bulbophyllum ipanemense, 8. involutum e 8. weddellii são orquídeas de campos rupestres que crescem diretamente sobre as rochas e são polinizadas por fêmeas de Pholeomyia (Diptera: Milichidae). Dezesseis amostras destas espécies, coletadas em diferentes localidades nos Estados de Minas Gerais, São Paulo e Bahia foram analisadas citoge netica mente. Somente cinco destas amostras apresentaram-se constituídas por indivíduos diplóides, com 2n=38, sendo as demais possivelmente poliplóides, com 2n=ca.72. As amostras diplóides foram analisadas quanto à estruturação e variabilidade genéticas através de eletroforese de isozimas utilizando oito locos enzimáticos. Foi encontrado grande polimorfismo enzimático e alta variabilidade genética (He entre 36,9% e 49,7%). O valor de !ir (=0,0524) para 8.ipanemense indica uma estruturação genética moderada, mas que não deve ser negligenciada. Estes resultados não são esperados em espécies de distribuição disjunta, cujos polinizadores são pequenos insetos que, julga-se, não sejam capazes de voar longas distâncias. Assim, a alta homogeneidade genética entre as amostras estudadas sugere que a dispersão de sementes nestas espécies deve ser um fator mais importante na manutenção do fluxo gênico do que geralmente se julga. Também é possível que amostras de diferentes localidades estejam sujeitas a diferentes pressões seletivas, pois o fluxo gênico não é totalmente livre, mesmo entre amostras de localidades bastante próximas. Isto indica que as amostras locais devem de fato representar populações distintas. A comparação com outro trabalho realizado com orquídeas também rupícolas e miiófilas de campos rupestres indica que a alta variabilidade encontrada pode estar relacionada às características ecológicas comuns a estas plantas. A alta incidência de indivíduos poliplóides sugere que esta possa ser uma característica com algum valor adaptativo no ambiente que estas plantas ocupam