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Resumo: O Brasil é um dos líderes mundiais na produção de etanol, sendo pioneiro no ramo do álcool combustível. No entanto, o país já enfrenta uma grande limitação imposta pela tecnologia de primeira geração de produção de etanol. Neste cenário, novas alternativas são propostas, com destaque à tecnologia de segunda geração, que consiste na utilização dos resíduos lignocelulósicos da cana-de-açúcar para a produção do combustível. Um dos maiores desafios dessa nova tecnologia é o desenvolvimento de uma levedura industrial capaz de produzir etanol não só a partir de hexoses (glicose) como habitual, mas também a partir de pentoses, que representam entre 15% a 45% do material lignocelulósico. Assim, o objetivo deste trabalho é utilizar e desenvolver ferramentas e metodologias de bioinformática e biologia sistêmica para estudar in silico a inclusão das vias redutiva/oxidativa e de isomerização de xilose em Pedra II (PE-II), uma cepa industrial da levedura Saccharomyces cerevisiae que teve seu genoma sequenciado pelo Laboratório de Genômica e Expressão da Unicamp. Foram incluídas as vias de consumo de xilose no modelo metabólico de S. cerevisiae e, por meio de análises de otimização de fluxo metabólico e desenvolvimento de modelos utilizando Petri Net estocástica, realizamos o estudo de possíveis alterações genéticas que contribuam para um aumento na produção de etanol a partir de xilose. Além disso, foi desenvolvido um pipeline de integração de dados ômicos, chamado Network Integrated Module (NIM), a partir de uma rede de proteína-proteína que possibilita novos insights sobre o mecanismo de regulação inferindo direcionamento nas arestas da rede

Resumo: A fenitoína e a carbamazepina são fármacos anticonvulsivantes de faixa terapêutica estreita, sendo indicada sua monitorização terapêutica. Neste trabalho descrevemos uma técnica de cromatografia líquida de alta resolução para medir os níveis plasmáticos dos anticonvulsivantes fenitoína, carbamazepina e fenobarbital nos pacientes do Ambulatório de Epilepsia do HC da UNICAMP, supervisionado pela Disciplina de Neurologia da FCM. Dosamos 925 amostras, com as quais obtivemos uma visão geral dos níveis plasmáticos de cada anticonvulsivante e detivemo-nos, com mais profundidade, na análise da distribuição dos pacientes segundo os níveis da fenitoína e da carbamazepina. As amostras dos usuários de fenitoína totalizaram 216 e apresentaram um alto percentual de níveis plasmáticos deslocados da faixa terapêutica (44,48% abaixo e 27,12% acima da FI) , indicando maior dificuldade de ajuste de doses. Além disso, 7 pacientes sob monoterapia apresentaram níveis plasmáticos muito acima da faixa terapêutica, sugerindo uma distribuição bimodal cuja explicação pode estar numa menor atividade enzimática devida à herança genética. Esses pacientes merecem uma investigação mais aprofundada. As amostras de carbamazepina totalizaram 421 e comparativamente à fenitoína, apresentaram um percentual menor de níveis plasmáticos deslocados da faixa terapêutica (9,74% abaixo e 22,09% acima da FI) . Mesmo no caso da carbamazepina, cujo percentual de amostras com nível dentro da faixa terapêutica é maior, o trabalho tomou clara a importância de um controle sistemático dos níveis plasmáticos para detecção da aderência ao tratamento e das variações metabólicas em nossa população, dentre cujas causas as diferenças genéticas- foram objeto especial de nossa atenção. Além das amostras de fenitoína e carbamazepina, foram dosadas ainda 96 de pacientes usuários de fenobarbital e 192 de pacientes sob regime de politerapia, cujos resultados foram descritos no capítulo 6 (apêndice). O método cromatográfico utilizado para as dosagens viabilizou a implantação de um serviço de rotina de controle dos níveis plasmáticos de anticonvulsivantes para o Departamento de Neurologia. Assim, cumprimos os objetivos propostos, e fornecemos subsídios para outros trabalhos que venham a ser desenvolvidos

Resumo: Burkholderia cenocepacia é uma bactéria Gram-negativa capaz de causar infecção crônica em indivíduos com fibrose cística. O estabelecimento da infecção crônica por B. cenocepacia depende da transição controlada de um estado móvel para o biofilme. Num estudo prévio de nosso grupo, foram identificados os genes hns1.1 e hns1.2, ambos codificados pelo cromossomo 1, que são requeridos para a motilidade bacteriana. Proteínas H-NS são reguladores globais da expressão gênica, principalmente de regiões adquiridas por transferência horizontal. Neste trabalho, buscamos caracterizar o papel dos três outros genes que codificam proteínas H-NS na fisiologia e patogenicidade de B. cenocepacia. Um desses genes (hns2) está presente no cromossomo 2, enquanto os outros dois (hns3.1 e hns3.2) estão localizados no megaplasmídeo pC3. Foram criados, por recombinação homóloga, mutantes simples em cada um dos genes hns e cepas contendo de dois a quatro destes genes deletados. Para determinar como essas deleções afetam a fisiologia bacteriana, comparamos as linhagens mutantes com as células parentais em ensaios fenotípicos e de expressão gênica. Embora nenhum dos mutantes tenha mostrado defeito de crescimento em meio rico, foi possível observar alterações de motilidade e formação de biofilme para algumas das cepas. O mutante simples ?hns3.1 apresentou motilidade aumentada e uma diminuição na formação de biofilme, sugerindo que esse gene possa desempenhar um efeito oposto àquele verificado para os genes hns do cromossomo 1. Para determinar a virulência dos mutantes simples, Galleria mellonella foi utilizada como modelo animal. Nessas análises, foram identificadas duas cepas mutantes com virulência atenuada, ?hns1.1 e ?hns3.1. Em relação às cepas com duas ou mais mutações, foram identificados dois tipos de interações funcionais. A combinação das deleções em hns1.1 e hns3.2 resultou em fenótipos que não foram observados nos mutantes simples correspondentes, como a mudança de cor da cultura líquida. Outro tipo de interação foi observada ao deletar hns2 em dois mutantes simples distintos, resultando em alterações dos fenótipos dos mutantes originais. Em conclusão, nossos dados revelam um gene hns com papel oposto àquele desempenhado pelos genes hns do cromossomo 1 e sugerem relações funcionais complexas entre os genes hns de B. cenocepacia

Resumo: Segundo a Organização Mundial de Saúde, doenças infecciosas são a segunda principal causa de morte no mundo. O peptidoglicano, um importante componente presente na parede celular de praticamente todas as Eubacterias, confere rigidez e forma além de ser importante em processos como divisão, crescimento e proteção contra osmólise. O mecanismo de inibição de sua síntese é o alvo de uma grande classe de antibióticos utilizados hà décadas com grande sucesso. O principal grupo desta classe são os compostos beta-lactâmicos, como a penicilina que, devido a semelhança estrutural com o substrato natural das proteínas PBPs (Penicillin Binding Proteins), são capazes de se ligar ao sítio ativo dessas proteínas. O mecanismo de inibição ocorre através da ligação covalente do anel beta-lactâmico ao domínio conservado TP (Transpeptidase) das proteínas PBPs, inibindo a atividade dessas proteínas que é essencial na última etapa da síntese do peptidoglicano. Devido ao sucesso bactericida, compostos beta-lactâmicos, como a penicilina, têm sido utilizados, com eficácia, há mais de 60 anos. Porém, as bactérias podem superar a ação de antibióticos através de diferentes formas, atualmente sabe-se que 25% de todas as linhagens invasivas de S. pneumoniae são resistentes à penicilina, principalmente devido à alterações estruturais no domínio TP das proteínas PBPs que impede a ligação dos compostos antibacterianos atualmente utilizados. Sendo assim, buscas por novos compostos que possam utilizar esse mesmo importante mecanismo de inibição têm sido incentivadas em todo o mundo. Os compostos naturais trazem uma grande diversidade química, incluindo substâncias inéditas, servindo como ótimos protótipos para o desenvolvimento de novos fármacos. Diante disso, este trabalho teve por objetivo, de um modo precursor no Brasil, utilizar bibliotecas comerciais, bem como bibliotecas recém montadas, contendo compostos naturais inéditos para testes na plataforma de High Throughput Screening do Laboratorio Nacional de Biociências (LNBio), juntamente com ensaios ortogonais bioquímicos e cristalográficas de modo a encontrar novos compostos ligantes ao domínio TP da proteína PBP2x de S. pneumoniae que poderão ser utilizados como ponto de partida para o desenho racional de novos fármacos. Um composto foi identificado e isolado apartir de uma fração etanólica de produto natural e mostrou-se sendo capaz de interagir com a PBP2x através de ensaio de anisotropia de fluorescência e Ressonância Magnética Nuclear, sendo portanto o primeiro inibidor não covalente reportado para esse alvo essencial à sobrevivência bacteriana

Resumo: O vírus Chikungunya (CHIKV) é um arbovírus emergente associado à artralgia ou artrite em humanos. A doença crônica tem características semelhantes à artrite reumatoide (AR), na qual as células dendríticas (DCs) e um ambiente hipóxico estão implicados na patogênese. O fator induzível por hipóxia (HIF1a) é um fator de transcrição que é ativado durante a hipóxia e desempenha um papel central nas respostas imunes ativando a transcrição de genes induzíveis por hipóxia. Assim, acreditamos que o desequilíbrio metabólico das DCs pode desempenhar um papel essencial na patogênese do CHIKV e no desenvolvimento de inflamação crônica. Para analisar o efeito de HIF1a em DCs para replicação e patogênese de CHIKV, analisamos a carga viral e a expressão gênica após a infecção quando HIF-1a foi inibido in vitro, usando células dendríticas derivadas da medula óssea (BMDCs) tratadas com BAY 87 ou in vivo, usando animais CD11ccre+HIF1afl/fl. A inibição de HIF1a em BMDCs não afeta a replicação viral, mas aumenta a expressão de enzimas glicolíticas envolvidas na inflamação. Camundongos CD11ccre+HIF1afl/fl infectados com CHIKV tiveram um aumento do inchaço da pata durante a infecção aguda e um aumento estatisticamente significativo na carga viral 3 dias após a infecção em comparação com os controles. Em concordância, esses animais apresentaram alteração na produção local e sistêmica de citocinas e quimiocinas em 3 e 7 dpi, favorecendo a infiltração de monócitos. Nas análises histológicas foram observadas alterações inflamatórias na pele, músculos e articulações, com infiltrado de células imunológicas e sinais de necrose muscular e sinovite, além disso observou-se ainda que, entre 3 e 7 dias de infecção, há uma progressão evidente da patologia, com aumento do dano tecidual. Em resumo, a ausência de HIF1a em células dendríticas promove indiretamente um aumento na infectividade, produção de citocinas, migração de monócitos e inflamação, durante a fase aguda da infecção por CHIKV em camundongos. Os achados reforçam que, além do controle viral, é essencial desenvolver terapias que também regulem a resposta inflamatória exacerbada para prevenir danos prolongados e sintomas crônicos semelhantes aos de doenças autoimunes