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Resumo: O objetivo deste trabalho foi estudar ação inseticida de Labramin, uma proteína que apresenta propriedades lectínicas, purificada de sementes de Labramia bojeri (Sapotaceae) sobre o inseto Anagasta kuehniella (Lepidoptera: Pyralidae). Este lepidóptero é um dos principais predadores de produtos armazenados como milho, trigo, arroz e farinhas. Foi avaliado o efeito de Labramin sobre os diferentes estágios do desenvolvimento, parâmetros nutricionais, e o efeito sobre as duas principais enzimas envolvidas na digestão de proteínas (tripsina e quimiotripsina) desse inseto. Dietas artificiais foram preparadas misturando trigo integral, germe de trigo, farelo de trigo e levedura com 0,25, 0,5 e 1,0% (p/p) da proteína. Dietas livres de Labramin foram utilizadas como controle. Os seguintes índices nutricionais foram mensurados: eficiência de conversão do alimento ingerido (ECI), eficiência de conversão do alimento digerido (ECD), digestibilidade aproximada (AD) e custo metabólico (CM). Os intestinos médios e fezes das larvas de 4° ínstar foram centrifugados e o sobrenadante utilizado nos ensaios enzimáticos. A atividade tríptica e quimiotríptica foi determinada usando como substratos BAPNA e SAAPPNA, respectivamente. Labramin 0,25% (p/p) afetou negativamente o crescimento e desenvolvimento de A. kuehniella, reduzindo o peso médio das larvas de 4° ínstar em 53% e prolongando a fase larval (14 dias) e pupal (2 dias). Apenas 43% das larvas neonatas alimentadas com Labramin 0,25% atingiram a fase adulta, enquanto o grupo controle aproximadamente 86% atingiu esse estágio. Labramin incorporada em dieta a 1% (p/p) provocou uma mortalidade de aproximadamente 90% das larvas. Larvas alimentadas com Labramin 0,25% mostraram baixos níveis de ECI e ECD e elevados níveis de AD e CM, demonstrando o potencial desta proteína inibir o consumo e a utilização do alimento. A atividade da enzima tripsina do fluido intestinal apresentou um aumento de 19%, bem como um aumento de 23 % na atividade dessa enzima nas fezes das larvas de 4° ínstar alimentadas com Labramin 0,25%. Estes resultados sugerem que Labramin afetou o mecanismo de reciclagem desta enzima. Em relação à atividade quimiotríptica, diferenças não significativa foram verificadas entre os tratamentos, tanto no intestino médio como nas fezes. Verificou-se através de ensaio de digestibilidade in vitro que Labramin é resistente à proteólise pelas enzimas digestivas deste inseto. Assim, Labramin é uma proteína que potencialmente poderá ser utilizada no combate de A. kuehniella e de outras pragas

Resumo: A esferocitose é um tipo comum de anemia hemolítica hereditária cujo primeiro defeito molecular foi caracterizado em 1992. A proteína banda 3, codificada pelo gene AE1, foi a primeira isoforma clonada de uma famma de genes de trocadores de ânions "Anion Exchanger-AE gene family" e é a mais abundante das proteínas integrais da membrana eritrocitária. Alterações moleculares neste polipeptídeo estão associadas à formação de esferócitos. Hemácias esferocíticas são osmoticamente frágeis, estando mais sujeitas à lise e ao sequestramento pelo baço, o que encurta seu tempo de vida. A proteína banda 3 também é expressa nos rins, na membrana basolateral de células alfa intercaladas do tubo coletor cortical, onde é responsável pela reabsorção de bicarbonato, compensando a secreção de ácidos pela H+ ATPase vacuolar apical, e participando da regulação fina do equilíbrio ácido-básico. Tanto a banda 3 eritrocitária como a renal são isoformas de um mesmo gene que através de um promotor tecido específico, diferem quanto à transcrição. O mRNA da banda 3 renal não apresenta os três primeiros exons observados na forma eritróide. O presente estudo teve o objetivo de investigar as alterações moleculares e regulação do gene da banda 3 na esferocitose hereditária em 5 pacientes com deficiência de banda 3, e investigar possíveis alterações neste gene em cinco pacientes com acidose renal tubular distal. Este estudo foi baseado no rastreamento de mutações e polimorfismos no gene mencionado, incluindo a região promotora, que também pode estar envolvida na fisiopatologia da doença. Para detecção das alterações moleculares foram utilizadas as técnicas de PCR, análise de polimorfismo de conformação em fita simples, subclonagem e sequenciamento. O estudo do cDNA foi realizado após a transcrição reversa do mRNA extraído de reticulócitos por RT-PCR. Outro objetivo foi investigar as alterações renais de pacientes com esferocitose hereditária e deficiência de banda 3, uma vez que esta proteína também é expressa nos rins. Os estudos renais foram realizados através da avaliação da capacidade de acidificação tubular distal e obtenção de medidas de bicarbonatúria, pH urinário, acidez titulável e excreção de amônia no período basal e após estímulo com furosemida. Também foi avaliado o contratransporte de sódio e lítio em hemácias de pacientes com esferocitose hereditária, uma vez que esta é uma medida indireta do contra-transporte Na+/H+, envolvido na regulação do pH intracelular do eritrócito e na homeostase ácido-básica do organismo, por secretar ácido e reabsorver Na+ em epitélio renal. Nossos resultados caracterizaram duas novas mutações no gene AEI. O estudo da Banda 3 Campinas, uma mutação no sítio doador de clivagem no intron 8, demonstrou a perda de bicarbonato pela urina dos pacientes afetados e um aumento na atividade de contra-transporte de sódio e lítio nas hemácias. A Banda 3 Pinhal, uma substituição de um resíduo de arginina altamente conservado, por histidina no domínio transmembrana, é a segunda mutação afetando o codon 490 da banda 3, e pode ser um "hot spot" para mutações no gene AEI. As hemácias destes pacientes apresentaram menor número de sítios para o inibidor DIDS. Outra mutação caracterizada foi a Banda 3 MODtefiore, previamente descrita. O estudo dos pacientes com acidose renal tubular distal revelou uma nova mutação na região promotora renal em um paciente com acidose renal tubular distal incompleta, que pode estar associada com o defeito na reabsorção de bicarbonato pelos rins. O estudo da acidose também caracterizou um novo polimorfismo no intron 3, a deleção da adenina 1233, com frequência alélica de 0,34 em 120 cromossomos analisados. Um conflito de sequência (quatro guaninas no lugar de três nt. 1272-1274) também foi verificado em todos indivíduos estudados. O polimorfismo Asp38-7Ala (Darmstad) foi encontrado em uma paciente com acidose, mas parece não estar relacionado com a doença. Finalmente concluímos que mutações no gene da banda 3 podem estar associadas com a esferocitose hereditária e com a acidose renal tubular distal incompleta, pois isoformas da proteína são expressas nas hemácias e nas células a-intercaladas. Sugerimos que em casos onde há perda de ânions pelos rins, mecanismos de compensação podem estar ativados, como o aumento da atividade excretora de prótons pela Na+/H+, ou pela H+-ATPase vacuolar apical. A fim de realizar estudos de interações protéicas, foi subclonado o domínio citoplasmático completo da fosfolípide scramblase dos seguintes tecidos humanos: cérebro, testículos e baço. A sequência do cDNA da enzima scramblase usada no ensaio duplo-híbrido resultou no fenômeno de auto-ativação, que é uma razão comum da falha do rastreamento pelo método duplo-híbrido

Resumo: A infecção crônica pelo vírus da hepatite B (HBV) é uma das causas do desenvolvimento do câncer de fígado. O genoma do HBV codifica a onco-proteína HBx, uma proteína multi-funcional de 17 kDa que possui 10 resíduos de cisteína, e que está relacionada com a indução do câncer de fígado em camundongos transgênicos para HBx. Apesar de não ter uma função definida, sabe-se que a proteína HBx é um potente trans-ativador transcricional, ativando a transcrição de muitos promotores virais e celulares através de interações proteína-proteína, uma vez que HBx não interage diretamente com o DNA de fita dupla. Desta forma, HBx pode afetar a replicação e proliferação virais, e interferir nos processos celulares de apoptose e carcinogênese. Neste trabalho, a proteína HBx foi expressa em E. coli, em fusão com a proteína GST ou com a cauda de poli-histidina, e utilizada em ensaios funcionais e estruturais. Através de ensaios de retardamento da mobilidade eletroforética e UV cross-linking, observou-se que a proteína HBx possui uma afinidade maior pelos oligonucleotídeos de RNA ricos em bases "A", "V" e "AV", com tamanho superior a 21-mer, e que os resíduos de cisteína não interferiram na ligação da HBx com o oligonucleotídeo de RNA AV-38. A ausência dos resíduos de eisteína da proteína HBx também não interferiu na ativação do promotor alvo para a proteína p53, em sistema de mono-híbrido em levedura, nem tampouco na interação in vitro da HBx com a proteína humana p53, o que foi confirmado através de um ensaio de co-precipitação. Em cultura de células HeLa, a proteína HBx causou um aumento do crescimento celular e uma leve uma estabilização dos mRNAs dos proto-oncogenes c-fos e c-myc, como mostraram os ensaios de cinética de degradação de mRNAs, e esta estabilização poderia contribuir para o fenótipo transformador da onco-proteína HBx. Os experimentos de dicroísmo circular e de fluorescência mostraram que a proteína HBx encontrava-se parcialmente estruturada em solução aquosa, mas apresentou uma tendência à estruturação sob determinadas condições experimentais, o que poderia ser uma conseqüência de uma provável flexibilidade conformacional inerente à proteína HBx. Vma estrutura flexível poderia explicar as interações observadas entre a HBx e uma variedade de proteínas celulares e ácidos nucléicos de fita simples, de modo que a proteína HBx poderia interferir nos processos de sinalização, transcrição, apoptose e nos mecanismos de reparo de DNA, que levariam ao desenvolvimento do câncer de fígado

Resumo: A doença vassoura-de-bruxa em Theobroma cacao (cacaueiro), causada pelo fungo Crinipellis perniciosa, é uma das doenças de maior impacto econômico nos países produtores de cacau, sendo o Brasil um destes países. Esse fungo infecta os tecidos meristemáticos do cacaueiro em duas fases: parasítica e saprofítica. Pesquisas com outros fitopatógenos têm demonstrado que a mudança da fase parasítica para a saprofítica é regulada por genes do sistema mating type tornando este estudo extremamente importante para inferir estratégias de combate à doença. O presente trabalho teve por finalidade identificar os genes mating type de C. perniciosa através da análise dos dados gerados pelo seu projeto genoma. Para a identificação dos genes do sistema mating type (Hd1, Hd2, Rc e Fe) foram feitas buscas no banco de dados do genoma de C. perniciosa comparando seqüências similares àquelas codificadas pelos fungos basidiomicetos Coprinus cinereus, Coprinus bilanatus, Schizophyllum commune e Ustilago maydis, identificadas e disponibilizadas em rede. Foram identificados seis genes do sistema mating type de C. perniciosa. Um gene que codifica a proteína regulatória Hd1, um gene que codifica a proteína regulatória Hd2 e quatro genes que codificam as proteínas receptoras de ferormônio Rc1, Rc2, Rc3 e Rc4. Não foram identificados genes que codificam ferormônios. Portanto, concluímos que a organização molecular do sistema mating type de C. perniciosa é tetrapolar, contendo o locus HD bialélico e o locus FRF multialélico

Resumo: A bactéria Xy/ella fastidiosa é responsável por várias doenças de plantas economicamente importantes, incluindo a clorose variegada do citros (CVC). Apesar de seu genoma já estar completamente sequenciado, os estudos das proteínas expressas pela bactéria são quase inexistentes. Na presente tese, foi utilizada a eletroforese de duas dimensões em combinação com a espectrometria de massas para identificar os produtos de 142 diferentes genes da X. fastidiosa, incluindo proteínas secretadas e as relacionadas com adesão, que apresentam particular interesse para o estudo da patogenicidade. Análise comparativa do perfil protéico da bactéria crescida como colônias isoladas em meio sólido de cultura com o da bactéria formando biofilme em meio líquido de cultura indicou a expressão específica de uma cisteíno protease, uma lipase e uma isoforma da subunidade da fímbria do tipo IV na condição de formação de biofilme. Análise do índice de uso de códons específicos ("codon bias") das proteínas mais expressas no extrato celular total revelou uma distribuição de valores inesperadamente baixa, o que é proposto como sendo possível causa da natureza fastidiosa da X. fastidiosa. Um banco de dados disponibilizando as informações geradas foi construído e pode ser acessado pela intemet: URL: www.proteome.ibLunicamp.br. Os resultados representam um esforço inicial para a caracterização da expressão de proteínas na X. fastidiosa e devem ajudar a promover um maior entendimento dos mecanismos de sobrevivência, adesão e secreção, bem como viabilizar subsequentes estudos de análise diferencial do proteoma da X. fastidiosa em diversos modelos experimentais. Na segunda parte da tese é mostrado um novo método para análise quantitativa de proteomas por espectrometria de massas. A estratégia proposta se baseia em marcar duas amostras a serem comparadas com diferentes formas isotópicas do reagente ICA T ("Isotope Coded Afinity Tags"), comigrá-Ias num único gel 2DE e identificar e quantificar as proteínas por espectrometria de massas. Os resultados mostram que proteínas rotuladas com as formas isotopicamente pesada e normal do reagente ICA T comigram na mesma posição em géis 2DE. Quando as proteínas são subsequentemente digeridas e analisadas por espectrometria de massas, a razão da abundância relativa das proteínas em cada amostra pode ser determinada precisamente, baseando-se nas intensidades relativas do sinal espectro métrico dos peptídios contendo as diferenças isotópicas. Utilizando esta estratégia, foi possível realizar quantificações com precisão melhor que 20 %.

Resumo: No processo de solubilização de lipídios e proteínas de membrana a escolha do surfatante é um passo fundamental. Um conhecimento detalhado das propriedades do surfatante se faz necessário na sua utilização em membranas biológicas. Neste trabalho determinamos algumas propriedades físico-químicas de dois novos surfatantes zwiteriônicos do tipo amidosulfobetaína, ASB-14 e ASB-16, e avaliamos seus efeitos sobre a solubilização de membranas eritrocitárias e suas proteínas. O ASB-16 por apresentar maior cauda hidrofóbica apresentou valor de CMC (concentração micelar crítica) cerca de 10 vezes menor que seu análogo ASB-14 nas condições estudadas (em água e em tampão PBS 5 mM, pH 7,4 a 25°C). Aplicando-se o tratamento clássico de Lichtenberg aos testes hemolíticos encontramos que o ASB-16 possui maior afinidade pelo ambiente membranar e seu efeito de solubulização sobre membranas eritrocitárias ocorre, portanto, em baixas razões surfatante/lipídio. O maior valor de partição e menor valor de CMC obtidos para o ASB-16 justificam seu efeito hemolítico superior. Além disso, ASB-14 e ASB-16 apresentaram efeitos hemolíticos superiores ao clássico Triton X-100. Dessa forma, esses resultados demonstraram que o comportamento agregativo e a interação hidrofóbica estão fortemente relacionados ao processo de solubilização. A solubilização das proteínas da membrana eritrocitária promovida pelo uso dos surfatantes ASB-14, ASB-16, CHAPS e Triton X-100 foi avaliada através da técnica de eletroforese bidimensional. Apesar do CHAPS solubilizar o maior número de proteínas que os demais surfatantes utilizados, o ASB-14 e ASB-16 mostraram-se capazes de solubilizar proteínas diferentes além de promoverem um aumento da solubilização de algumas proteínas. Portanto, nas condições experimentais utilizadas, a diferença entre o perfil de solubilização das proteínas e o efeito hemolítico induzido pelos surfatantes sugere que o fenômeno de hemólise não ocorre proporcionalmente à saída de proteínas da membrana. Os resultados obtidos nesse estudo sugerem que o uso de ASB-14 e ASB-16 em processos de solubilização de membranas e suas proteínas pode ser promissor e mais estudos sobre eles devem ser realizados

Resumo: Atualmente, morte celular por apoptose é objeto de intensa pesquisa devido à susceptibilidade de células tumorais, incluindo linhagens de células de leucemia e de linfoma, a sofrerem este tipo de morte celular em resposta a determinados agentes anti tumorais. O estresse oxidativo induzido, entre outros fatores, pela diminuição dos níveis de glutationa intracelular, está envolvido no mecanismo de ação de vários compostos, sinalizando as células ao processo apoptótico, envolvendo eventos mediados por cisteino proteases (caspases). Neste estudo, nós examinamos a indução de diferenciação morfológica e morte celular por apoptose pela dimetilamida-crotonina (DCR) em células da leucemia promielocítica humana HL60. A DCR é um derivado sintético da desidrocrotonina (DHC), uma diterpeno lactona extraída das cascas de Croton cajucara, uma planta da região amazônica. A DCR apresentou um efeito inibitório similar ao composto original conforme avaliado por diferentes parâmetros de citotoxicidade e ambos os compostos induziram diferenciação fenotípica em células HL60. Em contraste, não foram observadas citotoxicidade ou alterações morfológicas associadas com apoptose em linfócitos de sangue periférico humano após tratamento com os compostos em estudo nas concentrações utilizadas (O - 400flM). Com base nas alterações morfológicas, no padrão de &agmentação de DNA e na análise de simetria de membrana de células marcadas com anexina V liodeto de propídeo por citometria de fluxo, DHC e DCR induziram apoptose em células HL60 com a mesma eficiência. Ambos os compostos promoveram a ativação de caspases-2, -6 e -9. A ativação de caspase-9 pela DHC e DCR em células HL60 sugere indução de apoptose através da via mitocondrial. Com o intuito de analisar o possível envolvimento do estresse oxidativo no mecanismo de toxicidade dos compostos, foram determinados os níveis de glutationa e ocorrência de peroxidação lipídica. O nível de GSH diminuiu cerca de 30% e a produção de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) aumentou 4 vezes após o tratamento com ambos os compostos em concentrações próximas ao ICso (250 JlM). A suplementação do meio de cultura com 15 mM de GSH protegeu as células da toxicidade induzida pelos compostos em estudo. Nossos resultados indicam que a DCR e a DHC induzem apoptose em células HL60 em parte pela conjugação com GSH e indução de estresse oxidativo, o qual seria responsável pela peroxidação lipídica e ativação da cascata de caspases através da via mitocondrial. Além disso, resultados de espectroscopia UV Nis sugerem a formação de conjugados entre a GSH e o grupamento O=CH-CH=CH2, presente na DHC e na DCR. Desta forma, os compostos estudados possuem características almejadas para quimioterápicos desencadeando indução de diferenciação morfológica e de apoptose em células da leucemia HL60

Resumo: Xy/ella fastidiosa é uma bactéria Gram-negativa, limitada ao xilema, responsável por doenças em culturas de grande importância econômica, como a clorose variegada dos citros no Brasil e a doença de Pierce em videira. Devido à colonização de micro ambientes específicos sujeitos a uma forte pressão, supõe-se que a bactéria possua mecanismos de agregação entre células e entre essas e a parede dos vasos colonizados. Tal interação pode estar associada com sua patogenicidade. Assim, este trabalho teve por objetivo a avaliação dos genes diferencialmente expressos de X. fastidiosa em resposta a uma condição de simulação de adesão in vitro, através da análise de "microarrays" e do padrão 2D-PAGE de proteínas. A estirpe 9a Sc foi cultivada nas seguintes condições: bactérias planctônicas (C) x bactérias crescidas em suspensão em meio com lâminas de lenho (S) e C x bactérias aderidas às lâminas de lenho (L). Foram realizadas curvas de crescimento para padronização da fase exponencial, determinada de 4 a 6 dias para C e S e de 6 a 8 dias para L. Para a análises de microarranjos, os experimentos C x S, não foram encontradas diferenças significativa na de expressão no conjunto de genes avaliados. Enquanto em C x L , foram encontrados genes do metabolismo intermediários e componentes estruturais, como os que codificam proteínas de membrana e de transporte. No padrão 2D-PAGE, não foi possível a extração de proteínas das células bacterianas aderidas às lâminas de lenho pela presença de contaminante. Na análise C x S, nós identificamos algumas proteínas diferencialmente expressas, duas proteínas de membrana e uma cisteína-protease, esta última em sua forma funcional, ou seja, sem a porção N-terminal, que parecem estar envolvidas na adesão em outros organismos. Os resultados indicaram novos genes e proteínas que podem estar envolvidas no processo inicial de adesão de X. fastidiosa

Resumo: Este trabalho consistiu em avaliar biomarcadores de estresse oxidativo em portadores de Insuficiência Respiratória Crônica (IResC) em três momentos: antes, após 7 e ao longo de 270 dias de oxigenioterapia domiciliar prolongada (ODP). Medimos as atividades das enzimas catalase (CAT) e glutationa redutase (GR) no hemolisado, as concentrações de hemoglobina, lactato e ácido úrico (AU) no sangue total e as concentrações de grupamentos sulfidrilas totais (GST) e proteínas carboniladas (PC) no plasma desses pacientes por método espectrofotométrico. A saturação de oxigênio (Sp02) no sangue foi medida através de oxímetro de pulso. Comparamos, num primeiro momento indivíduos fumantes com pacientes com IResC e ambos com o grupo controle, de não fumantes. Observou-se que embora os dois grupos possuam níveis aumentados de estresse oxidativo, este foi muito maior no grupo IResC, representado principalmente pela diminuição nas atividades das enzimas CAT, GR e concentração plasmática de GST. Após sete dias de tratamento com oxigênio houve um aumento na Sp02 (P<O,OS), CAT, GR e AU (P<O,OS). Por outro lado, a concentração de GST manteve-se diminuída nesse período (P<O,OS). Os dados referentes aos pacientes submetidos a ODP ao longo de 270 dias mostraram que somente a atividade da GR apresentou-se significativamente diminuída nesse período (P<O.OS), indicando que a hípoxemia crônica produz efeitos prejudiciais que não são revertidos com a administração prolongada de oxigênio, que não é capaz, portanto de impedir a evolução clínica da doença

Resumo: As lectinas presentes nos venenos ofídicos são classificadas como lectinas tipo-C e são formadas por cadeias polipeptídicas relativas ao CRD (carbohydrate recognition domain) livre, sem domínios adicionais. BJcuL é uma lectina presente no veneno da serpente Bothrops jararacussu, isolada e caracterizada em nosso laboratório. Trata-se de um homodímero, com grande afinidade à galactose e apresenta atividades tóxica sobre células tumorais e endoteliais. Este trabalho teve como proposta: (1) determinar a seqüência completa do cDNA da lectina do veneno da serpente Bothrops jararacussu; (2) desenvolver um sistema de expressão, solubilização e purificação para a produção de BJcuL recombinante; (3) comparar a atividade da BJcuL recombinante com a nativa. Concomitante ao trabalho acima, foi também de nosso interesse: (4) investigar o efeito de BJcuL nativa sobre células tumorais do cólon quanto a proliferação/viabilidade, e produção de espécies reativas de oxigênio (ROS). O cDNA-BJcuL foi isolado da biblioteca de cDNA a partir da glândula de veneno de B. jararacussu. A seqüência do cDNA-BJcuL (GenBank acesso No. AY388642); apresentou uma região codificadora de aminoácido correspondente a BJcuL nativa e com um elevado grau de identidade com outras lectinas do tipo-C. O cDNA-BJcuL foi amplificado por PCR e ligado ao vetor de pET15b e usado para transformar E. coli BL21 (DE3). Uma proteína ,insolúvel e inativa, de 18,5 kDa foi expressa após a adição de 1 mM de IPTG. A rBJcuL foi desnaturada com 6 M de uréia, purificada e renaturada em coluna de afinidade, seguida de diálise e cromatografia em gel. A eficiência no processo de renaturação foi confirmada através de ensaios biológicos, dicroísmo circular e análise dos peptídios de rBJcuL. As células tumorais do cólon HT-29 D4 e Caco-2, após a adesão, foram incubadas com BJcuL (0 - 10 mM com 5% de FBS) por diferentes períodos (24, 48 e 72h). Ensaios de proliferação foram feitos usando o Kit BrdU-Elisa e uma interessante diminuição na incorporação de BrdU foi observada em ambas as células. BJcuL (2,5 µM) foi capaz de inibir aproximadamente 50% da proliferação em Caco-2 e 30% em HT-29 D4 em 24h. Este efeito, aparentemente não foi relacionado ao tênue desequilíbrio celular de ROS, cerca de 20% na presença de 2,5 µM de BJcuL, medido em fluorímetro (excitação em 490 nm e emissão a 538 nm) após a adição da sonda DCFH-DA. Ensaios com o reagente MTT confirmaram que BJcuL apresenta fraca citotoxicidade e não é capaz de diminuir a viabilidade dessas células. Com base nos resultados obtidos, buscamos desenvolver um estudo mais detalhado da estrutura molecular de BJcuL e suas funções, por meio da clonagem, seqüenciamento e expressão de rBJcuL, na intenção de fornecer dados para o esclarecimento das particularidades estruturais dessas proteínas

Resumo: Myocardial hypertrophy is one of the major responses to hemodynamic overload imposed by arterial hypertension. This elicits several histological and physiological alterations that affect the performance of the cardiac muscle as a whole. However, little is known about the molecular basis of the process, mainly because its multifactorial and polygenic trait. In this study, the DNA microarrays technique was adopted to identify genes directly involved in the establishment of myocardial hypertrophy. The experiments were based on the production of microarrays from 2304 clones of unknown identity derived from a non-normalized rat heart library. The microarrays were hybridized against cDNA targets synthesized after samples collect at short intervals (1, 3, 6, 12 and 48 hours) following hypertrophy induction by aorta constriction in rats (Rattus norvegicus). The results had confirmed the great potential of microarray technique for identification of differentially expressed genes in response to arterial hypertension, identifying the genes a-MHC, b-MHC and cardiac a-actin, previously described as involved in the process. More interesting, the gene of synaptopodin-2, protein associated with actin cytoskeleton and involved in stress fiber formation in response to mechanical stimuli in podocytes, and the gene of a precursor protein of amyloid beta A4, which is important because of its interaction with a protein that promotes the aggregation of components of MAPK (mitogen-activated protein kinase) cascade in a functional signaling module, were also identified. However, we concluded that it will be essential to utilize normalized libraries to reduce the redundancy of the selected genes, increasing the possibility to find novel genes

Resumo: Os objetivos deste trabalho foram purificar e caracterizar bioquimicamente uma lectina e determinar a estrutura primária de um inibidor de serinoproteinases tipo Kunitz de sementes da espécie D. regia (Leguminosae-Caesalpinioideae) e também verificar o efeito in vitro do inibidor sobre a atividade das enzimas digestivas dos insetos lepidópteros A. kuehniella e C. cephalonica. Para a purificação da lectina e do inibidor de serinoproteinases, as sementes foram trituradas e a farinha foi submetida a uma extração salina 10%. Após centrifugação, o sobrenadante (extrato total) foi dialisado, liofilizado e aplicado em colunas de exclusão molecular, troca iônica e coluna de fase reversa C18 em sistema de HPLC. As frações eluídas foram monitoradas a 280 nm de absorbância. A lectina e o inibidor purificados foram designados como DRL (Delonix regia lectin) e DrTI (Delonix regia trypsin inhibitor), respectivamente. Após a identificação e purificação, a lectina foi analisada em SDS-PAGE 12,5%, revelando que esta proteína tem massa molecular aparente de 12 kDa sob condições redutoras (DTT 0,1 M) e não redutoras. O gel nativo revelou que DRL é uma proteína constituída por apenas uma cadeia polipeptídica. Os testes de inibição da atividade hemaglutinante foram realizados com eritrócitos de ratos, utilizando-se os seguintes açúcares: D-glicose, D-glicosamina, D-frutose, D-manose, D-sacarose, D-galactose, D-galactosamina, D-rafinose, Dlactose e D-maltose e verificamos que a atividade hemaglutinante de DRL foi inibida mais especificamente por glicose a uma concentração de 0,048 mM, indicando que esta lectina pertence ao grupo glicose-manose. A composição de aminoácidos da lectina mostrou alto conteúdo de ácido aspártico, ácido glutâmico e glicina, mas nenhum resíduo de cisteína foi observado. A determinação da região N-terminal da lectina revelou alta homologia com outras lectinas de leguminosas tais como, con A, lentilha e ervilha. A faixa de pH para a atividade da lectina foi de 8-9 com perda total da sua atividade em faixa de pH ácido (2-4). Além disso, a lectina manteve sua atividade após tratamento térmico a 70°C, durante 30 minutos, com perda de 50% de sua atividade a 100°C. DRL não necessitou de cálcio para sua atividade, mas é dependente de manganês, sugerindo que DRL é uma metaloproteína. O tratamento de DRL com uréia resultou em perda total da AHE, enquanto que na presença do DTT, a lectina manteve sua atividade normal provavelmente devido à ausência de pontes dissulfeto na molécula. A determinação da estrutura primária do DrTI, comprovou que este inibidor pertence à família Kunitz de inibidores de proteinases. A região do sítio reativo possui um resíduo de ácido glutâmico ao invés de arginina ou lisina, mas a molécula apresentou dois "Ioops" compostos por quatro resíduos de cisteína com alta similaridade com outros inibidores tipo Kunitz. Os estudos de inibição in vitro mostraram que, numa concentração de apenas 5J.lg, o DrTI inibiu cerca de 92% da atividade das proteases dos insetos A. kuehniella e C. cepha/onica, indicando alta afinidade do inibidor por estas enzimas. A digestibilidade in vitro do DrTI pelas proteases dos insetos foi analisada em SDS-PAGE 12,5% e revelou que o inibidor foi resistente à proteólise após 72h. Entretanto, a incubação do DrTI com a tripsina bovina resultou em clivagem nos primeiros 30 minutos de reação. A atividade residual máxima do inibidor, após estes ensaios de digestibilidade pelas proteases de A. kuehniella, C. cephalonica e tripsina bovina foi de 69,5%, 64,9% e 34,57%, respectivamente

Resumo: O objetivo deste trabalho foi caracterizar e comparar a atividade enzimática da triparedoxina peroxidase (TXNp) em duas cepas de T. cruzi que apresentam diferentes resistências ao estresse oxidativo. A identificação da TXNp foi feita em extratos celulares totais da forma epimastigota de T. cruzi das cepas Y e Tulahuen 2. De um modo geral, a cepa Tulahuen 2 tem uma concentração maior desta enzÍma do que a Y. Variações na concentração da TXNp dentro de uma mesma cepa com origens geográficas diferentes também foi observada. A TXNp obtida em extratos celulares totais de T. cruzi epimastigotas possui função antioxidante, protegendo a glutamina sintetase (GS) contra as espécies reativas de oxigênio (EROs) produzidas pelo sistema oxidante DTT/Fe3+/02. Parece não estar envolvida com a proliferação celular, uma vez que uma correlação não pôde ser estabelecida através da análise por Western blotting entre os diferentes dias de crescimento e a quantidade desta proteína. A triparedoxina (TXN) também foi encontrada nos mesmos extratos e variações em sua concentração foram observadas quando as cepas e seus diferentes dias de crescimento foram comparados. Neste caso também as células Tulahuen 2 apresentaram uma maior concentração da TXN. Uma maior resistência às EROs geradas pelo sistema DTT/Fe3+/02 pode ser explicada pela maior concentração de TXN e TXNp encontradas. Isto levaria a um metabolismo de hidroperóxidos mais efetivo, quando comparado à cepay. Os "sheddings" de T. cruzi de ambas as formas (epimastigota e tripomastigota) mostraram a liberação de TXNp para o meio extracelular

Resumo: O óxido nítrico (NO) é uma espécie reativa de nitrogênio relativamente instável e possui grande versatilidade. Ele atua como mensageiro secundário, sendo inclusive citotóxico dependendo da sua concentração. Ações do NO como mensageiro secundário são descritas na neurotransmissão, regulação da circulação sanguínea e de processos inflamatórios, principalmente em mamíferos onde a enzima NO-sintase (NOS) foi descoberta. Em plantas, o NO possui importante papel na interação planta-patógeno, na expansão foliar e redução da velocidade de amadurecimento ou senescência de frutos e flores e no processo de apoptose, entre outros. Recentemente duas isoformas de NOS de plantas foram caracterizadas em Arabidopsis thaliana e pouco se sabe da modulação da expressão gênica por NO em plantas. Este trabalho relata a clonagem e caracterização de um gene que codifica uma NOS de A. thaliana e a modulação da expressão gênica em cana-deaçúcar em resposta GSNO, um doador de NO. partir de seqüências depositadas no banco de dados do NCBI, foram sintetizados oligonucleotídeos específicos. A partir de reações de transcrição reversa e PCR o gene foi clonado e seqüenciado, sendo denominado HHP. O gene é mais expresso em folhas e flores e é induzido quando plantas de A. thaliana são submetidas a baixa temperatura. A localização subcelular da proteína foi determinada via fusão com GFP, sendo predominantemente plastídica. Plantas de A. thaliana superexpressando o gene HHP apresentaram uma melhora acentuada na resposta ao frio. O efeito do NO na expressão gênica em cana-de-açúcar foi avaliado empregando macroarranjos de DNA. Foi detectado um aumento na expressão de alguns genes como por exemplo minotransferases e peroxidases, além de proteínas com função ainda desconhecidas. Foi também demonstrada a influência dos plásticos que selam membranas com macroarranjos de DNA, onde compostos a partir de polietileno podem bloquear a emissão de radiação e diminuir o número de spots detectados, o que significa um menor número de genes avaliados

Resumo: As leguminosas contêm quantidades relativamente grandes de proteínas e dentre essas proteínas destacam-se os inibidores de proteinases e lectinas. O objetivo do presente trabalho foi estudar o efeito de inibidores de proteinases sobre o desenvolvimento da Diatraea saccharalis e sobre microrganismos fitopatogênicos, assim como caracterizar físico-quimicamente uma lectina de Crota/aria paulina e estudar suas propriedades biológicas. A lectina das sementes de Crota/aria paulina foi purificada por cromatografia de troca iônica em coluna de DEAE Sepharose Fast Flow e em cromatografia de fase reversa-HPLC. A massa molecular determinada por eletroforese em gel de poliacrilamida em condições redutoras e não redutoras foi calculada em aproximadamente 30 kDa. A hemaglutinação induzida por CrpL sobre eritrócitos humanos e bovinos é inibida por N-acetil-D-galactosamina, D-galactose e pela glicoproteína asialofetuína. A lectina não requer íons divalentes para sua atividade, pois não é inibida por EDT A. A análise do conteúdo de carboidrato para CrpL indicou que esta lectina contém aproximadamente 6,2% de carboidratos, utilizando galactose e manose como padrões, o que comprova que esta lectina é uma glicoproteína. A composição global de aminoácido mostrou que a lectina é rica em resíduos de aminoácidos prolina, glicina, serina e alanina, e não apresenta resíduos de histidina, arginina, metionina e fenilalanina. A seqüência N-terminal apresentou-se bloqueada e os poucos resíduos obtidos não mostraram qualquer homologia com outras lectinas da família leguminosa. Estudos de agregação plaquetária induzida por ADP com plasma humano até a concentração de 100ug/ml de CrpL, demonstraram não haver modulação significativa sobre plaquetas. O estudo envolvendo CrpL sobre bactérias Xanthomonas campestris pv. phaseoli e Xanthomonas campestris pv. passiflorae, demonstrou que esta lectina afetou o crescimento dessas bactérias. As propriedades antimetabólicas dos inibidores de proteinases (IPs) de soja e feijão, foram determinadas "in vivo" após a incorporação em dieta artificial, com avaliação do potencial de crescimento de populações da broca-da-cana Diatraea saccharalis (Lepidoptera: Pyralidae). Os inibidores foram incorporados em dieta artificial à base de farelo de soja e levedura de canade-açúcar. O efeito dos inibidores sobre o desenvolvimento das lagartas de D. saccharalis foi avaliado aos 16 dias de idade para os diferentes tratamentos (T1, T2 e T3), através da viabilidade larval; % de eficiência de lagartas aptas; peso das lagartas e peso de pupas com 24 horas. Os inibidores de tripsina de soja e de feijão atrasaram o desenvolvimento das lagartas, além de interferir no peso. Foram analisados também, os inibidores de CpTI, CjTI, CsTI, SBTI e PvTI sobre o crescimento micelial de fungos do gênero Fusarium e Colletotrichum. Os experimentos foram conduzidos sobre placas de Petri, usando meio de BDA para Fusarium sp e meio de aveia para o Coletotrichum, com 10 repetições. Como controle foi usada água esterilizada. As placas foram deixadas á 28°C no escuro. Quando o controle alcançou o diâmetro total da placa, o experimento foi interrompido. Os inibidores mostraram diferentes efeitos sobre o crescimento de Fusarium s p "in vitro". O CpTI não mostrou qualquer efeito em relação ao controle, e o PvTI não teve efeito fungicida mas reduziu a concentração de hifas. Inibidor de CjTI foi capaz de ocasionar mudanças na morfologia do fungo. CjTI and PvTI mostrou efeito fungistático sobre o crescimento de Colletotrichum graminicola, sendo que o inibidor PvTI mostrou-se mais eficaz no controle do crescimento micelial. O SBTI não foi efetivo contra quaisquer espécies de fungos estudados. Estudos envolvendo CpTI e PvTI sobre a germinação de esporos de fungos da espécie Ustilago scitaminia, demonstrou que esses inibidores não têm efeitos sobre esses fungos. Inibidores de CpTI foram capazes de inibir o crescimento de duas espécies de bactérias, assim como BvcTI foi capaz de inibir o crescimento de Xanthomonas sp da cana de açúcar. PvTI não mostrou efeito sobre essas bactérias. Os resultados obtidos sugerem que CrpL, assim como os inibidores de proteinases estudados de várias sementes de leguminosas, podem estar envolvidos no mecanismo de defesa contra microrganismos fitopatogênicos. Os resultados com inibidores de serinoproteinases, de feijão e soja, sugerem, também, a possibilidade desses inibidores serem utilizados como ferramentas no estudo de plantas transgênicas de cana-de-açúcar no controle da broca (Diatraea saccharalis)

Resumo: As lectinas são proteínas ligantes de carboidratos, de origem não-imune, encontradas numa grande variedade de organismos. Aquelas isoladas de venenos de serpentes são constituídas de cadeias polipeptídicas relativas à região molecular correspondente ao domínio de reconhecimento de carboidrato (CRD) de lectinas. Devido às interações lectina ¿ carboidrato serem reversíveis, e não covalentes, estas moléculas podem ser utilizadas como importantes ferramentas bioquímicas. Este estudo tem como objetivo: (i) a caracterização da estrutura primária da lectina do veneno da serpente Bothrops jararacussu (BJcuL); (ii) a investigação do efeito de BJcuL sobre a adesão de células tumorais a proteínas da matriz extracelular, (iii) e sobre a proliferação destas e de células endoteliais. O seqüenciamento N-terminal de BJcuL revelou a presença de uma única seqüência, indicando que esta proteína é composta de cadeias idênticas. A determinação da estrutura primária da lectina realizada por meio de análise dos peptídeos obtidos pela fragmentação da proteína com c1ostripaína e protease SV-8, demonstrou que BJcuL possui os 18 resíduos invariantes que caracterizam o tipo C de lectinas animais. Este fato indica que BJcuL pertence à família das lectinas tipo-C ligantes de I3-galactosídeos e apresenta símilaridades estruturais com a região C-terminal do CRD das lectinas animais de membrana. Nos primeiros testes em cultura de células tumorais, a viabilidade celular foi avaliada após 5 dias de cultivo na presença da lectina. Nestas condições, a BJcuL inibiu 50% do crescimento das células de carcinoma de rins ou pâncreas em concentrações entre 1 e 2 mM. Em testes posteriores, foi observado que as células de carcinoma de mama ou de ovário foram capazes de aderir fracamente a BJcuL. Entretanto, esta adesão não inibiu a fixação destas células à proteínas da matriz extracelular tais como; fibronectina, laminina e colágeno tipo I. Após proliferação de linhagens tumorais por 4 dias na presença de BJcuL, foi observado um efeito inibidor dose-dependente da lectina em células tumorais de glioma e carcinomas de mama ou ovário. No intuito de verificar as propriedades anti angiogênicas da lectina, foi realizado um ensaio de proliferação de células endoteliais na presença de BJcuL. Os resultados mostraram que a BJcuL, numa concentração de 0,09mM, foi capaz de reduzir em 50% a viabilidade destas células. Os resultados aqui mostrados fornecem base para estudos acerca da estrutura molecular da BJcuL e suas funções, da caracterização da ligação lectina-carboidrato, e dos mecanismos envolvidos na ligação da lectina às superficies celulares

Resumo: A droga desidrocrotonina (DHC), isolada da planta Croton cajucara, é conhecida pelas suas atividades biológicas, entretanto apresenta uma vasta e conhecida toxicidade. Neste trabalho foram preparadas formulações contendo DHC associada a polímeros (PLGA) ou ciclodextrinas (beta, metil-beta e hidroxipropil-beta) para obter nanopartículas poliméricas e complexos de inclusão, respectivamente. Objetivamos neste trabalho a preparação das formulações de veiculação de DHC, sua caracterização e avaliação de parâmetros de toxicidade in vitro visando o estudo comparativo dos efeitos da DHC livre e veiculada. Células V79 e hepatócitos de ratos, sistemas celulares bem estabelecidos, permitiram avaliar alvos celulares como lisossomos, mitocôndrias e ácidos nucléicos frente aos possíveis danos tóxicos causados pela DHC. Nos hepatócitos, além dos parâmetros citados acima, também foi avaliada a quantidade de GSH existente nessas células, bem como a quantificação da peroxidação lipídica através da formação de TBARS e a atividade enzimática de enzimas do sistema de metabolização de drogas após tratamento com DHC livre e veiculada nos sistemas de liberação controlada ¿ nanoesferas de PLGA e complexos de inclusão com ciclodextrinas. Nossos estudos em forma geral, indicam que os polímeros ou complexos de inclusão são estruturas que conferem estabilidade à DHC, provocam liberação controlada e diminuição dos efeitos tóxicos da DHC

Resumo: Os microorganismos comumente usados na fermentação alcoólica são as leveduras, fundamentalmente a espécie Saccharomyces cerevisiae. Linhagens destas leveduras são utilizadas na produção de álcool para ser empregado como carburante em automóveis e para uso industrial na produção de perfumes e outros cosméticos, além de diversas bebidas fermentadas como cerveja vinho e destilados como cachaça. O álcool carburante tem grande importância para o Brasil, sendo produzido um volume de aproximadamente 170 bilhões de litros/ano. Em sua produção, o processo de centrifugação é o passo mais dispendioso e consome grande parte da energia utilizada pela usina. Na indústria vinícola e nas destilarias de produção de cachaça o passo crucial para a qualidade do vinho é o de decantação de leveduras, sendo que um tempo muito longo causa variações indesejáveis ao sabor pela liberação de compostos secundários das leveduras que permanecem em suspensão. Neste trabalho foi desenvolvido um protótipo com linhagens de levedura para torná-Ias floculantes condicionais. O gene FL05 foi colocado sob o controle de promotores reprimíveis por glicose e esta construção foi usada para transformar linhagens de laboratório. Desta maneira as células se tornaram capazes de se separar do meio de cultura por sedimentação após a exaustão do açúcar. Esta é uma tecnologia promissora que visa substituir a centrifugação na produção de etanol carburante e melhorar a qualidade das bebidas produzidas com base em fermentação. Este processo foi objeto de uma patente depositada no INPI sob o nº0001122 e negociado com a empresa GeneSearch, sendo uma das 7 patentes já negociadas na história da UNICAMP

Resumo: Croton cajucara Benth (sacaca) é uma espécie vegetal encontrada na região amazônica e é populannente utilizada para o tratamento de distúrbios digestivos. Foram investigadas a atividade anti-ulcerogênica e a citotoxicidade de compostos sintetizados a partir da desidrocrotonina, constituinte majoritário obtido das cascas de sacaca. Através de modelos de úlceras agudas, induzi das por agentes como etanol/HCI, indometacina e estresse, em camundongos, foi possível constatar que os derivados U (ciclohexenona reduzida) e IV (amida) reduziram significativamente as lesões ulcerativas na maioria dos modelos estudados. O derivado lU (ciclohexenona e lactona reduzidas) não aprçsentou efeito protetor sobre a mucosa gástrica. A citotoxicidade destes compostos foi avaliada em células V79 e hepatócitos usando três diferentes ensaios de viabilidade: incorporação do vermelho neutro, redução do MTT e conteúdo de ácidos nucleicos. O derivado 11 apresentou um efeito citotóxico basal sobre as células V79 (ICso entre 350 e 540 Jlm). Contudo, em cultura de hepatócitos foi verificado um efeito citotóxico seletivo observado através de uma toxicidade elevada (ICso 8 JlM) avaliada através da redução do MIT. O derivado 111 apresentou menor citotoxicidade quando comparado com a desidrocrotonina, derivado 11 e derivado IV (ICso = 1800 JlM verificado através do conteúdo de ácidos nucleicos). Os resultados obtidos neste estudo indicam que a atividade anti ulcerogênica da desidrocrotonina e dos derivados é dependente da presença de aceptores de Michael e que, a citotoxicidade está diretamente relacionada com a presença do anel da lactona

Resumo: A dor crônica ou aguda pode ser controlada utilizando-se anestésicos locais (AL), substâncias que agem ao longo dos axônios impedindo a transmissão do estímulo nervoso. Os AL são moléculas anfifílicas e por isso seu mecanismo de ação é modulado por interações com a bicamada lipídica, além de com a proteína canal de sódio voltagem-dependente dos axônios. Muitos AL utilizados clinicamente apresentam toxicidade que é proporcional a potência, sendo um grande desafio o desenvolvimento de medicamentos mais potentes e menos tóxicos. A modificação da molécula anestésica por síntese química é uma alternativa interessante, mas hoje em dia muitos trabalhos estão voltados para o desenvolvimento de sistemas de liberação controlada de drogas. A adição em veículos viscosos, encapsulação em lipossomas ou microesferas e a complexação em ciclodextrinas são exemplos promissores da tecnologia desenvolvida atualmente no sentido de minimizar fatores de risco para os pacientes, além de aumentar a potência medicamentosa, diminuindo a freqüência de aplicação do medicamento. Este trabalho teve como objetivo principal o desenvolvimento de formulações anestésicas locais de longa duração, com Benzocaina (BZC) encapsulada em lipossomas ou complexada com r3-ciclodextrina e o preparo e caracterização de formulações similares de Bupivacaina (BVC) e Lidocaina (LDC) visando a redução da toxicidade dos ALs e prolongamento da duração da anestesia através da liberação controlada dos fármacos. Foram realizados testes de caracterização físico-química quanto à estabilidade e eficácia, além de testes de citotoxicidade in vitro, comparando-se com formulações convencionais. Os anestésicos também foram comparados entre si e em relação aos veículos utilizados. No caso da Benzocaína, a formulação em ciclodextrina mostrou-se menos tóxica em ensaios in vitro além de levar a um aumento significativo da solubilidade aquosa do AL, permitindo sua utilização por via i nfiltrativa , como os demais AL.Testes de toxicidade in vitro demonstraram que houve uma diminuição geral da toxicidade das formulações contendo LDC e BVC. Com isto, a formulação de LDC em lipossomas e a de BVC em ciclodextrina também são promissoras quanto à diminuição da toxicidade e aumento do tempo de ação de anestesia

Resumo: Dentre os fármacos usados para aliviar ou eliminar a dor, encontram-se os anestésicos locais (AL). Esses compostos, capazes de bloquear a excitação-condução em nervos periféricos, têm duração de ação relativamente curta e toxicidade para os sistemas nervoso central e cardiovascular. Com a finalidade de prolongar a duração de ação e reduzir a toxicidade sistêmica dos AL, pesquisas com diferentes tipos de sistemas carreadores têm sido desenvolvidas. Essas novas formulações, denominadas de liberação lenta, possibilitam a liberação controlada e evitam picos plasmáticos dos AL, prolongando a analgesia e reduzindo sua toxicidade. Neste trabalho objetivamos preparar, caracterizar (quanto a encapsulação ou complexação, estabilidade e liberação da droga) e avaliar in vitro (toxicidade celular) e in vivo, a atividade farmacológica (latência, intensidade, duração de ação e toxicidade local) de novas formulações anestésicas de liberação controlada, comparando-as com os fármacos disponíveis no mercado. Os AL de escolha foram as amino-amidas cíclicas: Bupivacaína (BVC), Mepivacaína (MVC) e Ropivacaína (RVC), bastante utilizadas em clínica médica e odontológica. Os sistemas carreadores de drogas adotados foram lipossomas unilamelares grandes (LUV de 400nm, compostos de fosfatidilcolina e colesterol) e as ciclodextrinas: ß-CD ou hidroxipropil ß-CD (HPß-CD). Ensaios de estabilidade física, por fluorescência, revelaram que os lipossomas mantêm o conteúdo encapsulado e que a presença do AL não interfere na permeabilidade dos mesmos, analisada em função do tempo e temperatura. O coeficiente de partição foi calculado e indicou o perfil esperado pelas substituições, i.e., MVC<RVC<BVC (93,132 e 136, respectivamente). Testes de estabilidade química não indicaram mudanças nos índices de peroxidação lipídica em até 4 meses de estocagem (a 4ºC) após encapsulação dos AL. Porém, análises por espalhamento de luz mostraram aumento no tamanho das vesículas após 30 dias de preparação, inviabilizando o uso das mesmas por períodos maiores. A complexação com CDs foi evidenciada através de calorimetria diferencial de varredura, que detectou alterações na temperatura de fusão dos AL puros, bem como perda do pico endotérmico referente à desidratação da cavidade da ciclodextrina, nos sistemas de BVC e RVC complexadas com ß-CD e HPß-CD. Imagens de microscopia eletrônica de varredura confirmaram que há perda da estrutura cristalina dos AL e CDs puros, após a complexação. Experimentos de solubilidade de fases revelaram aumento linear na solubilidade da BVC e RVC em função da concentração de CDs, além de permitir o cálculo da constante de associação entre AL:ß-CD (8,9 e 7,9 M-1) e AL:HPß-CD (14,7 e 10,0 M-1) para BVC e RVC, respectivamente. Através de ensaios in vitro (diálise) observou-se diminuição nas taxas de liberação de BVC e RVC complexadas e de RVC encapsulada em lipossomas, em relação aos AL livres, indicando que a interação com esses carreadores alterou a permeação dos AL através de membranas. Os ensaios de toxicidade, em cultura de fibroblastos e em eritrócitos humanos, revelaram diminuição na toxicidade dos AL após complexação com CDs (BVC e RVC) ou encapsulação em lipossomas (MVC e RVC). Nos ensaios in vivo observou-se que, após o bloqueio do nervo infraorbital em ratos, as formulações lipossomais (MVCLUV e RVCLUV) prolongaram a duração e aumentaram a intensidade da analgesia em relação aos AL livres ou associados a vasoconstritores (no caso da MVC), sugerindo as formulações de AL encapsulados em lipossomas como alternativa ao uso de vasoconstritores em procedimentos cirúrgicos prolongados e manutenção da analgesia pós-operatória, especialmente em Odontologia. Com relação à avaliação do bloqueio motor, a injeção dos AL livres, encapsulados ou complexados alterou, de maneira dose-dependente, a função motora dos animais após bloqueios caudal (injeção intratecal) e do nervo ciático (infiltração) havendo a perda reversível dos reflexos motores em todos os animais testados. Nenhuma das formulações de AL testadas, tanto com ß-CD, HPß-CD ou LUV, prolongou ou intensificou a potência do bloqueio motor induzida por BVC e RVC. No entanto, nos sistemas BVCHPß-CD e RVCHPß-CD observou-se redução significante na latência ou tempo para instalação do bloqueio, indicando um início de ação mais rápido, sem modificar a duração do bloqueio motor, o que é bastante desejável. Já a avaliação do bloqueio sensorial do nervo ciático de camundongos, demonstrou que os sistemas BVCHPß-CD, RVCHPß-CD e RVCLUV e induziram aumento na intensidade e duração da analgesia em relação aos AL livres ou complexados com ß-CD, tornando-os de grande interesse para uso no período pós-operatório. A injeção intratecal de BVCHPß-CD 0,5% também aumentou o limiar de nocicepção dos animais em relação à BVCß-CD e BVC livre, mostrando aumento na potência e duração da analgesia. Esse resultado, em particular, nos permite sugerir que o aumento da potência anestésica (ca 1,5 vezes), obtido com as formulações deve-se, além de ao aumento na concentração total de AL (em água e associado ao carreador) disponibilizada pelas formulações, à menor ligação dos anestésicos com proteínas do líquor e/ou sua menor captação pela circulação; mantendo o AL por mais tempo em contato com a membrana neuronal. Em avaliação neurohistológica encontramos sinais de neurotoxicidade em alguns dos animais tratados com o complexo BVCHPß-CD (a 0.5%de BVC) que não foram observados após injeção de HPß-CD ou BVC, isoladamente. A potencialização do efeito tóxico da BVC pela complexação com HPß-CD deve-se à maior disponibilidade do AL em contato com a membrana neuronal, sugerindo que o uso do complexo em concentrações menores (como 0,25%), reduziria o efeito neurotóxico sem modificar a potência anestésica. Além disto, a análise nefrohistológica não detectou quaisquer indícios de alterações morfofuncionais após o tratamento dos animais com HPß-CD, BVC ou BVCHPß-CD após administração intratecal, confirmando a potencialidade do uso clínico desta formulação anestésica

Resumo: Dietas hiperlipídicas (HL) são fatores de risco para doenças metabólicas. A alimentação fracionada (padrão nibbling) parece prevenir tais desordens, e dietas com poucas e volumosas refeições (padrão gorging) podem causar obesidade e picos na insulinemia. O objetivo deste estudo foi avaliar o desenvolvimento de obesidade, de intolerância à glicose e de dislipidemia em ratas submetidas a diferentes freqüências de ingestão alimentar em dietas controle (11% de lipídeos) ou HL (39% de lipídeos). Ratas Wistar foram acompanhadas por 8 semanas, tendo sido divididas em 4 grupos: CG (controle gorging, com ingestão de ração comercial lx/dia durante 2h/dia); HLG (HL gorging, com consumo de HL lx/dia por 2h/dia); CN (controle nibbling, com acesso 24h/d à ração comercial) e HLN (HL nibbling, com acesso 24h/d à ração HL). O consumo alimentar foi limitado para igualar a ingestão energética entre os 4 grupos. Foram realizados OGTTs (testes orais de tolerância à glicose), dissecações e pesagens dos tecidos adiposos, extrações de gorduras dos tecidos, análises séricas e de glicogênio. Animais em HL apresentaram maior peso e maiores depósitos de tecido adiposo. A incorporação de gorduras na carcaça foi maior em CG (88,1 i: 21,0 mglg) que CN (55,7 i: 11,2 mglg), porém semelhante entre HLG (101,9 i: 19,2 mglg) e HLN (101,3 i: 14,3 mglg). CG e CN apresentaram maior conteúdo de glicogênio muscular que HLG e HLN. Grupos gorging apresentam maior teor de glicogênio hepático. Não foram detectadas diferenças na insulinemia, colesterolemia, trigliceridemia, albuminemia e nas concentrações de HDLcolesterol sérico, porém HLG apresentou a maior glicemia basal. A curva glicêmica de animais em HL apresentou glicemias mais elevadas que os controles. Houve prejuízo na tolerância à glicose também em resposta ao padrão gorging. O padrão gorging causou maior acúmulo de gorduras nos animais em dieta com restrição de gorduras, mas não aumentou o já eficiente acúmulo de tecido adiposo da alta ingestão de lipídeos. A associação da HL ao padrão gorging induziu prejuízos na tolerância à glicose. Estudos futuros serão importantes para melhor caracterizar a evolução da síndrome metabólica em resposta a estes comportamentos alimentares

Resumo: Muitos compostos tem sido estudados com o intuito de investigar as atuações na proteção dos sistemas biológicos contra danos oxidativos. Entre estes destacam-se os flavonóides, compostos de origem vegetal com capacidade de inibir reações radicalares em sistemas biológicos. As propriedades antirraricais destes compostos relacionam-se diretamente ao 'OH e O2'-, bem como o radical peroxil e alcoxil. Alternativamente os flavonóides podem atuar como antioxidantes, devido a capacidade de quelarem íons metálicos, o que pode contribuir para a inibição da peroxidação lipídica na membrana do eritrócito. Na presente investigação foi estudado o efeito da rutina " in vitro" e " in vivo" sobre a oxidação da hemoglobina (Hb) e peroxidação da membrana eritrocitária de ratos tratados com fenilhidrazina (PHZ), uma droga com características oxidantes, as quais estão relacionadas ao radical fenil e ânion superóxido, gerados pela PHZ. Os resultados "in vitro" mostraram o comportamento pró-oxidante da rutina em presença de PHZ sobre os grupos tióis reativos da Hb, GSH, oxidação da Hb, ligação da Hb à membrana do eritrócito, peroxidação lipídica da membrana eritrocitária e hemólise isotônica. Os dados cromatográficos em HPLC de fase reversa mostrara que a pré-incubação da rutina com a PHZ deu origem a dois produtos (pr-1 e pr-2). Estes quando testados na oxidação da Hb, mostraram efeito oxidante maior que a própria PHZ, exacerbando a formação de metaHb. Ao contrário dos resultados "in vitro", a rutina conferiu proteção contra os danos oxidativos da PHZ "in vivo" tanto na oxidação da Hb, quanto sobre os grupos tióis reativos da Hb, GSH, ligação da Hb à membrana do eritrócito, formação de corpos de Heinz, peroxidação lipídica da membrana eritrocitária e resistência globular osmótica. Estes resultados foram obtidos com o sangue de ratos tratados durante 10 dias com administração intraperitoneal de rutina. A análise do plasma destes animais em HPLC de fase reversa revelou a presença de um pico que possuía tempo de retenção diferente do pico de rutina, sugerindo ser um metabólito do flavonóide. O grupo de animais que recebeu a administração intraperitoneal de 1,5 mM de rutina durante 10 dias foi o que apresentou menores danos em presença de 60 mg PHZlKg de animal. Isto foi evidenciado através da análise da morfologia dos eritrócitos nos esfregaços sanguíneos, bem como por todos os experimentos de oxidação realizados com o sangue destes animais

Resumo: Enzimas importantes em muitos sistemas celulares são inibidas ou ativadas por flavonóides. No entanto, não existe nenhum dado literário referente ao efeito dos flavonóides sobre as fosfoproteínas tiro sina fosfatase (PTP). Este trabalho propõe o estudo dos flavonóides sobre a atividade da fosfoproteína tirosina fosfatase de baixa massa molecular relativa (LMrPTP) de rim bovino relacionando a sua estrutura com o seu efeito sobre a atividade enzimática. A atividade enzimática foi determinada em pR 5,0 utilizando pnitrofenilfosfato (p-NPP), flavina mononuc1eotídio (FMN) e tirosina fosfato (Tyr-P) como substratos, a 37°C, por 20 minutos. Quercetina mostrou ser um ativador da enzima na concentração de 400 JlM, da ordem de 260,20 e 10% para p-NPP, FMN e Tyr-P respectivamente. Já a murina mostrou ser um excelente inibidor competitivo da atividade enzimática, com constantes de inibição da ordem de 58, 56,5 e 55 JlM/ L para p-NPP, FMN e Tyr-P respectivamente. Diferentemente do efeito ativador da quercetina, o efeito inibidor da murina foi dependente do pR. Estudos de estabilidade térmica na ausência e presença de agentes protetores ou redutores indicam que os flavonóides interagem com o sítio ativo mas não afetam as cisteínas. A interação entre a enzima e os flavonóides envolve fortemente um componente eletrostático, uma vez que na presença de NaCI houve a perda do efeito ativador da quercetina e a ativação por murina em concentrações superiores a 125mM. Para as mesmas condições, outros flavonóides foram testados, mas não apresentaram efeito significativos na atividade da LMrPTP, como a rotina e o kaempferol. Estes resultados sugerem a importância da posição dos grupos -aR dos flavonóides (nas posições 3' e 4' para a quercetina, 2' e 4' para a murina) para os distintos efeitos dos flavonóides. A ausência do grupo -aR na posição 3' (para o kaempferol) e a presença de um glicosídio (rotinose) no grupo -aR na posição 3 (para a rotina) promovem a supressão do efeito ativador do flavonóide sobre a atividade da enzima