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Resumo: Citocromos P450 (CYP) constituem uma superfamília de heme proteínas envolvidas na fase I da biotransformação que participa da detoxificação de compostos endógenos e exógenos. Para que esta atividade seja exercida existe a necessidade da associação do CYP com o citocromo b5 e com a enzima NADPH citocromo P450. Esta associação só ocorre graças ao ambiente de membrana. Qualquer alteração na uniformidade do ambiente lipídico leva à alterações na funcionalidade do sistema CYP. Baseado nesta informação e no fato de que vários poluentes têm sua solubilidade aumentada pela adição destes compostos, realizamos testes in vitro utilizando microssomas hepáticos de Curimbatá (Prochilodus scrofa) - um peixe tropical brasileiro pertencente a família Prochilodontidae - e observamos que dois surfactantes normalmente utilizados na solubilização de pesticidas, o Triton X- 100 e o Tween 80. O conteúdo total de CYP e a atividade da EROD foram fortemente inibidos pelo Triton X-100 e pelo Tween 80 de uma maneira dose dependente; o conteúdo de CYP foi reduzido à zero. A atividade da EROD foi completamente inibida pelo Triton X-100 e inibida em mais de 40% na presença do Tween 80. A estrutura molecular do surfactante influencia na alteração que o sistema irá sofrer visto que ambos são hábeis em interagir com as proteínas do sistema microssomal, em especial as monooxigenases, alterando sua conformação e, consequentemente, destruindo sua função. Os resultados desta primeira parte mostraram que os surfactantes interagem com os componentes do sistema microssomal hepático levando a inibição do sistema. A atividade do CYP, que foi usada como biomarcadora de exposição ao xenobiótico pode ser utilizada como marcadora em associação com outras enzimas. Estes resultados levantaram a hipótese de que os surfactantes também poderiam alterar a atividade do CYP quando utilizados em processos de purificação. Por ser uma proteína de membrana, o CYP precisa ser solubilizado antes de ser purificado. No entanto os surfactantes utilizados durante o processo poderiam levar a destruição do CYP, mascarando a real concentração do CYP obtido durante o processo. Sendo assim, na segunda parte deste trabalho desenvolvemos um novo método de purificação que exclui a necessidade de surfactantes durante o processo de purificação. A purificação do CYP1A foi feita utilizando-se uma coluna C18 associada à HPLC de fase reversa. O CYP purificado foi caracterizado em relação as suas propriedades eletroforéticas, imunoquímica e atividade biocatalítica. A fração isolada como CYP produz uma única banda uniforme com massa molecular ao redor de 58.000 Da em SDS - PAGE e mostra uma forte reatividade cruzada com anticorpos produzidos contra o CYP1A de trutas. A fração isolada também foi encapsulada em dois tipos de sistemas reconstituídos, um composto por lipídeos neutros e outro por lipídios negativamente carregados. Em ambos os sistemas foi possível detectar a atividade da EROD, mas não a atividade da PROD, confirmando que a fração purificada corresponde a CYP1A e teve todas as suas características enzimáticas conservadas. Houve um aumento da atividade quando a o CYP1A foi encapsulado nas vesículas contendo lipídeos negativamente carregados, confirmando que a carga do lipídeo é essencial para a manutenção das características enzimáticas do CYP. O processo se mostrou eficaz para a purificação do CYP1A mantendo todas a suas características conservadas. No entanto não permitiu a separação das isoformas CYP1A. A terceira parte do projeto teve como objetivo a identificação das isoformas CYP1A1 e CYP1A3 através de eletroforese bidimensional associada à espectrometria de massas do tipo MALDI-TOF. Foram identificados 3 spots com a mesma massa molecular, mas com pIs variando entre 5,5 e 6,5, sugerindo a presença de três isoformas do CYP1. Os spots foram selecionados e tratados com tripsina. O mapa de peptídeos obtidos através da digestão dos spots selecionados teve suas massas identificadas por espectrometria de massas do tipo MALDI-TOF e através da digestão teórica de seqüências de CYP já existentes no banco de dados. Houve a identificação de 10 picos que correspondem a 31% do total de aminoácidos traduzidos para a família CYP1A de peixes e mamíferos. Todos os três spots tiveram o mesmo padrão de fragmentação confirmando que eles são isoformas CYP1A1 e CYP1A3. Dentre estes peptídeos, dois demonstraram maior importância, o pico T3, que representaria um domínio conservado do CYP1A e o pico T2, que representaria uma região conservada apenas em peixes. Os resultados sugerem fortemente que este novo procedimento seria eficiente para identificar, simultaneamente, diferentes isoformas do CYP1A hepático e suas regiões conservadas. Dada a sensibilidade das técnicas de proteômica, nesta ultima fase do projeto propomos o uso da eletroforese bidimenisonal associada à espectrometria de massas na identificação de isoenzimas de P450 diferencialmente expressas em microssomas hepáticos de Curimbatás tratados com 3 ¿ metilcloranteno (3-MC). A avaliação das proteínas expressas em cada tratamento foi feita através de eletroforese uni e bidimensional e a identificação feita através da análise de massa de peptídeos. Ambas as eletroforeses permitiram a identificação de proteínas induzidas de maneira diferencial pelo 3-MC, embora a eletroforese tenha sido mais efetiva na identificação de proteínas altamente homólogas, como a CYP1A1 e CYP1A3. Também foi possível a identificação de outras proteínas atuantes na detoxificação de xenobióticos, dentre elas o citocromo b5 (~15kDa) e a glutationa ¿ S ¿ Transferase microssomal (~20kDa). Os dados demonstrados no projeto mostram claramente que o sistema associado a abordagem proteômica têm um grande potencial para serem utilizados na identificação de proteínas expressas diferencialmente conforme a situação ambiental