Resumo: A interação entre as células-tronco hematopoéticas (HSCs) e o microambiente da medula óssea (MO) é essencial para a regulação da hematopoese; e a interação entre as células leucêmicas e o microambiente é essencial para a leucemogênese. O microambiente é composto por diversos tipos celulares como: células endoteliais, osteoblastos e células mesenquimais estromais (MSCs). As células leucêmicas são capazes de modificar a interação com as MSCs e promover a leucemogênese. Nosso grupo de pesquisa identificou, por ensaio de microarranjo, a hiperexpressão do fator de crescimento vascular endotelial A (VEGFA) em células CD34+ e a hiperexpressão de Semaforina 3A (SEMA3A) em MSCs da MO de pacientes com síndrome mielodisplásica (SMD) do tipo ARSA. VEGFA é o fator pró-angiogênico mais estudado, está aumentado em pacientes com leucemia mielóide aguda (LMA) e correlaciona-se com pior prognóstico. SEMA3A é uma proteína secretada que parece ter efeitos antiangiogênicos em tumores sólidos. A competição entre VEGFA e SEMA3A pelo receptor neuropilina 1 (NRP1) tem sido discutida. O objetivo desse estudo foi entender a interação entre VEGFA e SEMA3A na MO de pacientes com SMD e LMA e sua função na patogênese. Para investigar a expressão gênica de VEGFA em células CD34+, recrutamos 18 pacientes com SMD e 16 com LMA e descrevemos, por RT-PCR, aumento da expressão de VEGFA em pacientes com LMA de novo comparado ao grupo controle (5,06 [0,42¿57,52] vs 1,00 [0,8¿2,19], P=0,0073). Para investigar a expressão gênica de SEMA3A em MSCs, recrutamos 25 pacientes com SMD e 17 com LMA e encontramos aumento da expressão de SEMA3A em todas as amostras comparando ao grupo controle: SMD de baixo risco (2,97 [0,64¿24,39] vs 0,83 [0,43¿2,86], P=0,028); SMD de alto risco (9,50 [2,34¿22,60] vs 0,83 [0,43¿2,86], P=0,005); LMA secundária (3,07 [0,97¿6,97] vs 0,83 [0,43¿2,86], P=0,05) e LMA de novo (5,73 [1,10¿28,21] vs 0,83 [0,43¿2,86], P=0,007). Para investigar os efeitos de VEGFA em células CD34+ normais e em células leucêmicas, nós hiperexpressamos VEGFA em células leucêmicas KG1 e células CD34+ de sangue de cordão umbilical. A hiperexpressão de VEGFA aumentou a viabilidade de células KG1 (124,4± 23,03% vs 100± 0,62%; P=0,03) e de células CD34+ (159,6± 41,2% vs 102,5 ± 16,93%; P=0,045); e a proliferação de células KG1 (107,7± 2,82%; P=0,042) e de células CD34+ (134,0± 7,68%; P=0,047); comparado ao controle. Para estudar a interação entre VEGFA e SEMA3A, hiperexpressamos SEMA3A em células HS5 e realizamos ensaios de cocultura. A cocultura de células KG1 ou CD34+ hiperexpressando VEGFA com células HS5 aumentou a proliferação (176,9± 46,34%; P=0,045) de células KG1 de células CD34+ (131,8± 7,9%; P=0,02). A cocultura de células KG1 ou CD34+ com células HS5 hiperexpressando SEMA3A diminuiu a proliferação (93,15± 0,79%; P=0,004) de células KG1; e de células CD34+ (72,73± 4,72%; P=0,009). Quando combinamos a hiperexpressão de VEGFA e de SEMA3A, os efeitos de SEMA3A são dominantes. Para investigar se o efeito dominante de SEMA3A está relacionado a competição por NRP1, realizamos ensaio de imunoprecipitação utilizando células HS5 e KG1 tratadas com as proteínas recombinantes VEGFA e SEMA3A. No tratamento combinado das duas proteínas recombinantes, há maior formação de complexos entre os receptores Plexina A4 e NRP1, favorecendo a sinalização de SEMA3A. Nossos resultados sugerem que a hiperexpressão de VEGFA confere vantagens às células leucêmicas, aumentando a proliferação, e que SEMA3A parece anular os efeitos causados por VEGFA. Portanto, acreditamos que o uso de inibidores de VEGFA combinado com a proteína SEMA3A pode ser benéfico no tratamento dos pacientes Ver menos

Abstract: The cross-talk between hematopoietic stem cells (HSCs) and the bone marrow (BM) microenvironment is essential for hematopoiesis regulation; and the cross-talk between leukemic stem cells (LSCs) and the bone marrow (BM) microenvironment is essential for leukemogenesis. The BM microenvironment compromises several cellular types such as endothelial cells, osteoblasts and mesenchymal stromal cells (MSCs). LSCs are capable of modifying the interaction with MSCs and promoting leukemogenesis. Our group performed a microarray assay and identified VEGFA overexpression in CD34+ cells and SEMA3A overexpression in MSCs from bone marrow of myelodysplastic syndrome RARS patients. VEGFA is the most studied angiogenic factor; is increased in acute myeloid leukemia (AML) patients, and correlates with a worse prognosis. SEMA3A is a secreted protein that appears to have antiangiogenic effects in solid tumors. A competition between VEGFA and SEMA3A for the neuropilin 1 (NRP1) receptor binding has been reported. The aim of this study was to reach a better understanding of VEGFA and SEMA3A interaction in the bone marrow of MDS and AML patients and the role of this interaction in pathogenesis. To investigate VEGFA expression in CD34+ cells, we recruited 18 MDS and 15 AML patients and described, by RT-PCR, increased VEGFA expression in de novo AML patients compared to the control group (5.06 [0.42¿57.52] vs 1.00 [0.8¿2.19], P=0.0073). To investigate SEMA3A expression in MSCs, we collected 25 MDS and 17 AML bone marrow samples and we found increased SEMA3A expression in all samples compared to the control group: low-risk MDS (2.97 [0.64¿24.39] vs 0.83 [0.43¿2.86], P=0,028); High-risk MDS (9.50 [2.34¿22.60] vs 0.83 [0.43¿2.86], P=0.005); secondary AML (3.07 [0.97¿6.97] vs 0.83 [0.43¿2.86], P=0.05) and de novo AML (5.73 [1.10¿28.21] vs 0.83 [0.43¿2.86], P=0.007). In order to investigate VEGFA effects in AML cells and CD34+ normal cells, we overexpressed VEGFA in KG1 leukemic cells and in CD34+ from umbilical cord blood. The VEGFA overexpression increased KG1 (124.4± 23.03% vs 100± 0.62%; P=0.045) and CD34+ cells (159.6± 41.2% vs 102.5 ± 16.93%; P=0.042) viability; and KG1 (107.7± 2.82%; P=0.042) and CD34+ cells (134.0± 7.68%; P=0.047) proliferation compared to control cells. In order to investigate the interaction between SEMA3A and VEGFA, we overexpressed SEMA3A in HS5 stromal cell line and performed co-culture assays. The co-culture of KG1 or CD34+ cells overexpressing VEGFA with HS5 cells showed increased KG1 proliferation (176.9± 46.34%; P=0.045) and CD34+ proliferation (131.8± 7.9%; P=0.02). The co-culture of KG1 or CD34+ cells with HS5 cells overexpressing SEMA3A showed decreased KG1 proliferation (93.15± 0.79%; P=0.004) and CD34+ proliferation (72.73± 4.72%; P=0.009). When we combined VEGFA and SEMA3A overexpression, the effects of SEMA3A were dominant over VEGFA. To investigate whether the dominant effect of SEMA3A could be due to NRP1 competition, we performed immunoprecipitation assay using KG1 and HS5 treated with VEGFA and SEMA3A recombinant proteins. The combined treatment of VEGFA and SEMA3A proteins induced increased complex formation between NRP1 and Plexin A4 receptors, favoring SEMA3A signaling. Ours results suggest that VEGFA overexpression confer AML cells advantages by increasing proliferation. SEMA3A seems to reverse the effects of VEGFA. We suggested that the use of SEMA3A protein combined with VEGFA inhibitors could be beneficial to AML patient¿s treatment Ver menos