Resumo: A lignina é um heteropolímero aromático de origem vegetal que figura como a segunda maior fonte de carbono orgânico não fóssil na biosfera. Porém, sua recalcitrância e heterogeneidade estrutural impõem desafios técnicos consideráveis para sua conversão em produtos de maior valor agregado. Bactérias do gênero Xanthomonas capazes de catabolizar compostos derivados da lignina são uma potencial fonte de soluções biotecnológicas para essa questão, mas isso ainda é pouco explorado. No genoma de X. axonopodis pv citri 306, identificamos os genes XAC0353 e XAC0354, que codificam proteínas ainda não caracterizadas, com baixa identidade de sequência com proteínas de estrutura conhecida, e potencialmente relacionadas a vias cruciais nos processos de conversão da lignina. Ambos codificam oxidorredutases, sendo XAC0353 predito codificar uma álcool desidrogenase e XAC0354 uma aldeído desidrogenase. Por fazerem parte de um operon putativo, formulamos a hipótese de que XAC0353 e XAC0354 atuam em série na bioconversão de aromáticos de lignina, de modo que o produto da primeira (um aldeído) seja o substrato da segunda. Diante disso, este trabalho teve como objetivo elucidar a estrutura e a função dessas proteínas, utilizando como principais abordagens a cristalografia por difração de raios X e a caracterização bioquímico-cinética dos alvos in vitro. As proteínas foram expressas em E. coli e purificadas à homogeneidade por cromatografia de afinidade e exclusão molecular. XAC0353 forma hexâmeros em solução que aparentemente se combinam em dodecâmeros dependendo da composição do meio, de acordo com ensaios de DLS e SEC-RALS/LALS. XAC0354 forma trímeros com tendência a dissociação em dímeros e monômeros segundo análises de SEC-RALS/LALS. Nos experimentos de cristalização, apenas XAC0353 formou cristais, que difrataram a uma resolução máxima de 3,2 Å. Tentativas de resolução do problema das fases foram bem-sucedidas, mas otimizações serão futuramente realizadas na tentativa de se aumentar a resolução dos dados. Ambas as enzimas têm preferência pelo NAD+ como co-substrato. XAC0353 mostrou alta especificidade para o álcool coniferílico (4,63 x 105 s-1.M-1), sendo inibida por ele a partir de determinadas concentrações (Ki = 3,3 ± 0,3 mM). Além disso, ela apresentou atividade contra o álcool 4-hidroxibenzílico (6,19 x 103 s-1.M-1), o álcool vanílico (3,35 x 103 s-1.M-1) e uma atividade residual contra o álcool benzílico. XAC0354 apresentou o seguinte perfil de especificidade: vanilina (5,30 x 104 s-1.M-1) ~ 4-hidroxibenzaldeído (5,02 x 104 s-1.M-1) > coniferaldeído (3,56 x 104 s-1.M-1) > 3,4-hidroxibenzaldeído (1,41 x 104 s-1.M-1) ~ benzaldeído (1,30 x 104 s-1.M-1) e também apresentou inibição pelo substrato, exceto para o benzaldeído. Diante desses resultados, confirmamos que XAC0353 e XAC0354 apresentam funções bioquímicas que lhes permitem atuar em série na bioconversão de compostos derivados da lignina, revelando-as como enzimas de potencial interesse biotecnológico para valorização desse abundante resíduo agroindustrial. A promiscuidade de substratos observada favorece a exploração e otimização dessas enzimas através de abordagens de engenharia enzimática e evolução dirigida visando aplicações industriais. Estudos futuros a partir de análises estruturais, mutagênese sítio-dirigida e nocauteamento gênico poderão fornecer maiores informações quanto aos mecanismos que regem a especificidade de substratos/co-substratos e sobre a importância fisiológica dessas enzimas Ver menos

Abstract: Lignin is an aromatic heteropolymer of plant origin that figures as the second largest source of non-fossil organic carbon in the biosphere. However, its recalcitrance and structural heterogeneity pose considerable technical challenges for its conversion into higher value-added products. Bacteria of the Xanthomonas genus capable of catabolizing compounds derived from lignin are a potential source of biotechnological solutions for this issue, but this is still little explored. In the genome of X. axonopodis pv citri 306, we identified the genes XAC0353 and XAC0354, which encode uncharacterized proteins, with low sequence identity with proteins of known structure, and potentially related to crucial pathways in the processes of lignin conversion. Both encode oxidoreductases, with XAC0353 being predicted to encode an alcohol dehydrogenase and XAC0354 an aldehyde dehydrogenase. As they belong to a putative operon, we hypothesized that XAC0353 and XAC0354 act in series in the bioconversion of lignin aromatics, so that the product of the first (an aldehyde) is the substrate of the second enzyme. Therefore, this work aimed to elucidate the structure and function of these proteins, using as main approaches X-ray diffraction crystallography and the biochemical-kinetic characterization of the targets in vitro. The proteins were expressed in E. coli and purified to homogeneity by affinity and size exclusion chromatography. XAC0353 forms hexamers in solution that apparently combine into dodecamers depending on the composition of the medium, according to DLS and SEC-RALS/LALS assays. XAC0354 forms trimers with a tendency to dissociate into dimers and monomers according to SEC-RALS/LALS analyses. In the crystallization experiments, only XAC0353 formed crystals, which diffracted at a maximum resolution of 3.2 Å. Attempts to solve the phase problem were successful, but optimizations will be carried out in the future to increase the resolution of the data. Both enzymes prefer NAD+ as a co-substrate. XAC0353 showed high specificity for coniferyl alcohol (4.63 x 105 s-1.M-1), being inhibited by it above certain concentrations (Ki = 3.3 ± 0.3 mM). In addition, it showed activity against 4-hydroxybenzyl alcohol (6.19 x 103 s-1.M-1), vanillyl alcohol (3.35 x 103 s-1.M-1) and a residual activity against benzyl alcohol. XAC0354 showed the following specificity profile: vanillin (5.30 x 104 s-1.M-1) ~ 4-hydroxybenzaldehyde (5.02 x 104 s-1.M-1) > coniferaldehyde (3.56 x 104 s-1.M-1) > 3,4-hydroxybenzaldehyde (1.41 x 104 s-1.M-1) ~ benzaldehyde (1.30 x 104 s-1.M-1) and showed inhibition by the substrate, except for benzaldehyde. These results confirm that XAC0353 and XAC0354 have biochemical functions that allow them to act in series in the bioconversion of compounds derived from lignin, revealing them as enzymes of potential biotechnological interest for the valorization of this abundant agro-industrial residue. The observed substrate promiscuity favors the exploration and optimization of these enzymes through enzymatic engineering and directed evolution approaches aiming industrial applications. Future studies based on structural analyses, site-directed mutagenesis and gene knockout may provide more information about the mechanisms that govern substrate/co-substrate specificity and about the physiological importance of these enzymes Ver menos