Resumo: A anaplerose do ciclo do TCA por glutamina, uma importante fonte energética e biossintética para células em elevada divisão celular, é prejudicada pela inibição da glutaminase. A inibição da glutaminase por CB-839 está em teste clínico como tratamento de múltiplos tumores sólidos e hematológicos. HuR (Human antigen R) é uma proteína codificada pelo gene ELAVL1. HuR apresenta três domínios de ligação à RNA e liga a elementos ricos em AU, afetando a estabilidade e o splicing do RNA. Achados prévios relacionam HuR à estabilização do mRNA da isoforma de glutaminase chamada de glutaminase C (GAC) em acidose renal e seu ortólogo, HuD, ao splicing alternativo de GLS em células neuronais. Com base nisto, nós hipotetizamos que HuR seria um importante regulador de glutaminase em câncer. Inicialmente nós avaliamos dados de transcriptômica pan-câncer do TCGA e observamos que pacientes com alta expressão de ELAVL1 apresentam aumentado risco de recidiva tumoral, sendo que em câncer de mama observamos um Cox hazard ratio (HR) de 1,82. Além disto, utilizando dados públicos de RNA-Seq, RIP-Seq e PAR-CLIP-Seq nós mostramos que HuR liga ao intron 14 de GLS e controla seu splicing, levando à escolha da isoforma kidney-type glutaminase (KGA) frente à GAC. Em adição, empregando células de câncer de mama e próstata e HEK293 (com um knock-in produzido por CRISPR/Cas9 onde foi inserido gene para proteína fluorescente no C-terminal de KGA) nós confirmamos que HuR aumenta os níveis de KGA por afetar o splicing e a estabilidade do mRNA. O silenciamento lentiviral de ELAVL1 prejudicou a proliferação, migração, invasão e aumentou o vício em glutamina de células de câncer de mama in vitro. O tratamento de células de câncer de mama silenciadas para ELAVL1 com CB-839 teve efeito sinérgico no sentido de afetar proliferação e invasão celulares in vitro. Nós propomos HuR como um fator de prognóstico em câncer de mama, com impacto especialmente no metabolismo de glutamina através da regulação de splicing do gene GLS. Nesta tese, nós também apresentamos em anexo sete artigos publicados que participei como co-autor, sendo quatro em co-primeira autoria Ver menos

Abstract: TCA cycle anaplerosis by glutamine, an important energetic and biosynthetic source for rapidly dividing cells, is impaired by glutaminase inhibition. Glutaminase inhibition by CB-839 is currently under clinical trials for treating multiple solid and haematological tumors. HuR (Human antigen R) is a protein encoded by the ELAVL1 gene. HuR contains three RNA-binding domains and binds cis-acting AU-rich elements, affecting mRNA stability and splicing. Previous findings have linked HuR to GLS mRNA stabilization in renal acidosis, and its ortholog, HuD, to GLS splicing in neuronal cells. We then hypothesized that HuR was an important glutaminase regulator in cancer. We first inquired a TCGA pan-cancer cohort and found that patients with higher ELAVL1 expression had increased risk of tumor recidive (Cox HR of 1.82 for breast cancer). Moreover, by using publicly available RNA-Seq, RIP-Seq and PAR-CLIP-Seq data we showed that HuR binds to GLS intron 14 and controls GLS splicing, leading to kidney type glutaminase (KGA) choice over glutaminase C (GAC). Using breast and prostate cancer and HEK293 (with a CRISPR/Cas9 knock in) cell lines we further confirmed that HuR increases KGA by affecting splicing and mRNA stability. Lentiviral ELAVL1 silencing impaired breast cancer cell¿s proliferation, migration, invasion and increased glutamine addiction in vitro. Treating silenced ELAVL1 breast cancer cells with CB839 further impaired proliferation and invasion. We proposed HuR as a prognostic factor in breast cancer, with special impact on glutamine metabolism through splicing regulation. In this thesis, we also present seven published articles on which I participated as a co-author, being four as co-first author Ver menos