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Type: DISSERTAÇÃO DIGITAL
Degree Level: Mestrado
Title: Exossecreções de larvas de dípteros (Diptera: Calliphoridae) : padronização para obtenção e avaliação in vitro da sua ação sobre a forma promastigota de Leishmania amazonensis
Title Alternative: Exosecretions of Diptera larvae (Diptera: Calliphoridae) : standardization for obtaining and in vitro evaluation of their action on the promastigote of Leishmania amazonensis
Author: Ansaloni, Leticia Salvioni, 1994-
Advisor: Thyssen, Patricia Jacqueline, 1973-
Abstract: Resumo: A terapia larval (TL) consiste na utilização de larvas vivas e desinfetadas de moscas necrófagas, criadas em laboratório, sobre feridas de difícil cicatrização visando promover, sobretudo, o processo de reparação tecidual. Além do desbridamento, exercido pelas larvas durante sua alimentação, é conhecido que as excreções e secreções (ES) liberadas pelas mesmas podem ter um importante papel no combate ou controle aos microrganismos que por ventura se encontrem no ambiente da ferida. Protozoários do gênero Leishmania causam a leishmaniose, a qual em humanos pode se manifestar clinicamente nas formas tegumentar ou visceral. O tratamento para esta doença tem sido feito através de medicamentos com alto custo e nem sempre eficazes, devido ao surgimento de resistência ou ainda alta toxicidade. No presente estudo objetivou-se (i) padronizar os métodos para obtenção de ES larvais de dípteros focando o melhor custo-eficácia para uso em experimentações in vitro, (ii) avaliar in vitro o potencial leishmanicida das ES de Chrysomya megacephala (Fabricius) e Cochliomyia macellaria (Fabricius) (Diptera: Calliphoridae) sobre a forma promastigota de Leishmania amazonensis, (iii) analisar o perfil das proteínas presentes nas ES de cada uma das espécies de dípteros visando correlacionar os padrões obtidos com os mecanismos de ação das ES frente aos promastigotas do parasito, (iv) obter curvas dose-resposta das ES de Ch. megacephala e Co. macellaria contra promastigotas e (v) avaliar se as ES tanto de Ch. megacephala quanto de Co. macellaria são capazes de alterar a morfologia dos promastigotas de L. amazonensis. As espécies de dípteros em questão foram selecionadas devido à sua ampla distribuição em território brasileiro e fácil manutenção em laboratório. Em relação à obtenção das ES, o método que atendeu aos critérios de melhor custo-eficácia foi aquele em que as larvas de terceiro estádio foram submetidas ao jejum (processo pré-extração), permaneceram por 1 h em salina a 37ºC no escuro (processo de extração) e cujo seus produtos (ES) foram esterilizados usando filtro bacteriológico (processo pós-extração). Foi possível identificar que as ES das duas espécies de moscas contêm proteínas de peso molecular entre 11 e 80 kDa. Todos os experimentos in vitro para avaliar a ação das ES sobre os promastigotas foram realizados em triplicata e repetidos três vezes em placas com 96 poços a 26ºC. Em cada poço foram adicionados 100 µL de meio RPMI com uma concentração de 5x105 promastigotas + 100 µL contendo diferentes concentrações de ES (Co. macellaria: [4], [3], [2], [1,15], [1] e [0,5] mg/mL; Ch. megacephala: [21], [11], [2], [1] e [0,5] mg/mL). Grupos controles (meio RPMI e Anfotericina B) foram observados simultaneamente. Quanto à ação das ES de ambas as espécies, foi significativa na inibição da proliferação de promastigotas de L. amazonensis, em particular nas concentrações mais altas (ES[4], [3] e [2] mg/mL para Co. macellaria; ES[21] e [11] mg/mL para Ch. megacephala; p< 0,0001). Os valores estimados da EC50 das ES de Co. macellaria para cada intervalo de observação, 12 h, 24 h e 48 h respectivamente, foram 2,8, 2,4 e 1,9 mg/mL, enquanto para Ch. megacephala foram 10,4, 14,5 e 5,8 mg/mL. Nas maiores concentrações de ES de Co. macellaria ([4] ,[3] e [2] mg/mL) e de Ch. megacephala ([21] e [11] mg/mL) e em todos os intervalos de exposição notou-se que os promastigotas de L. amazonensis apresentaram deformidade no corpo celular e diferenças relativas ao comprimento do corpo celular e dos flagelos. Concluiu-se que as ES das duas espécies podem ser promissoras para o controle ou inibição de promastigotas de L. amazonensis

Abstract: Larval therapy (LT) consists of using live and disinfected larvae of necrophagous flies, reared in the laboratory, on wounds that are difficult to heal, aiming mainly to promote tissue repair. In addition to the debridement performed by the larvae during their feeding, it is known that the excretions and secretions (ES) released by them can play an important role in fighting or controlling the microorganisms that may be present in the wound environment. Protozoa of the genus Leishmania cause leishmaniasis, which in humans can manifest clinically in cutaneous or visceral forms. The treatment for this disease has been done through drugs with high cost, but not always effective due to the appearance of resistance or high toxicity. The present study aimed to (i) standardize the methods for obtaining larvae ES from dipterans focusing on the best cost-benefit for use in in vitro experiments, (ii) evaluate in vitro the leishmanicidal potential of the ES of Chrysomya megacephala (Fabricius) and Cochliomyia macellaria (Fabricius) (Diptera: Calliphoridae) on the promastigote form of Leishmania amazonensis, (iii) to analyze the profile of proteins present in the ES of each blowfly species in order to correlate the patterns obtained with the mechanisms of action of the ES against the promastigotes of the parasite, (iv) obtain dose-response curves of the ES of Ch. megacephala and Co. macellaria against promastigotes and (v) evaluate whether the ES of both Ch. megacephala and Co. macellaria are capable of altering the morphology of the promastigotes L. amazonensis. The blowfly species in this study were selected due to their wide distribution in Brazilian territory and easy maintenance in the laboratory. In relation to obtaining ES, the method that reached the best cost-benefit criteria was the one whose larvae were fasted (pre-extraction process), remained for 1 h in saline at 37ºC in the dark (extraction process) and its products (ES) were sterilized using a bacteriological filter (post-extraction process). It was possible to identify that the ES of the two blowfly species contains proteins with molecular weight between 11 and 80 kDa. All in vitro experiments to evaluate the action of ES on promastigotes were performed in triplicate and repeated three times in 96-well plates at 26ºC. In each well, 100 µL of RPMI medium with a concentration of 5x105 promastigotes + 100 µL containing different concentrations of ES (Co. macellaria: [4], [3], [2], [1,15], [1] were added to each well) and [0.5] mg/mL; Ch. megacephala: [21], [11], [2], [1] and [0.5] mg/mL). Control groups (RPMI and Amphotericin B) were observed simultaneously. Regarding the action of the ES of both species, a significant inhibition of the proliferation of L. amazonensis promastigotes was observed, particularly at the highest concentrations (ES[4], [3] and [2] mg/ mL for Co. macellaria; ES[21] and [11] mg/mL for Ch. megacephala; p< 0.0001). The estimated EC50 values of the ES of Co. macellaria for each observation interval, 12 h, 24 h and 48 h, respectively, were 2.8, 2.4 and 1.9 mg/mL, whereas for Ch. megacephala were 10.4, 14.5 and 5.8 mg/mL. In the highest concentrations of ES from Co. macellaria ([4], [3] and [2] mg/mL) and from Ch. megacephala ([21] and [11] mg/mL) and at all exposure intervals it was noted that L. amazonensis promastigotes showed deformity in the cell body and differences in cell length and flagella. It was concluded that the ES of the two species can be promising for the control or inhibition of L. amazonensis promastigotes
Subject: Mosca-varejeira
Medicamentos - Desenvolvimento
Saúde pública
Leishmaniose
Bactérias
Language: Multilíngua
Editor: [s.n.]
Citation: ANSALONI, Leticia Salvioni. Exossecreções de larvas de dípteros (Diptera: Calliphoridae) : padronização para obtenção e avaliação in vitro da sua ação sobre a forma promastigota de Leishmania amazonensis. 2021. 1 recurso online (91 p.) Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia, Campinas, SP.
Date Issue: 2021
Appears in Collections:IB - Tese e Dissertação

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