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Type: DISSERTAÇÃO DIGITAL
Degree Level: Mestrado
Title: Genetic engineering of Saccharomyces cerevisiae for co-fermentation of xylose and glucose to second-generation ethanol production : Engenharia genética de Saccharomyces cerevisiae para cofermentação de xilose e glicose e produção de etanol de segunda geração
Title Alternative: Engenharia genética de Saccharomyces cerevisiae para cofermentação de xilose e glicose e produção de etanol de segunda geração
Author: Bueno, João Gabriel Ribeiro, 1995-
Advisor: Santos, Leandro Vieira dos, 1982-
Abstract: Resumo: A matriz energética mundial tem como base o uso de compostos fósseis, como o petróleo, gás e carvão. Entretanto, nas últimas décadas, a comunidade mundial manifestou uma intensa preocupação relacionada às consequências causadas pelo uso desses compostos, como o aumento dos gases causadores do efeito estufa. O etanol de segunda-geração (2G), produzido a partir biomassa lignocelulósica, surge com um grande potencial na produção de energia limpa a partir de uma matriz renovável. Entretanto, diversos desafios tecnológicos precisam ser superados visando uma produção economicamente viável de etanol 2G. O desenvolvimento de linhagens modificadas da levedura Saccharomyces cerevisiae, capazes de converter o açúcar de cinco carbonos xilose (C5) em etanol, é um passo essencial na viabilização da tecnologia 2G, tendo em vista sua significativa parcela na composição da biomassa. Um grande gargalo na implementação dessa tecnologia é a baixa eficiência de assimilação de xilose por transportadores de membrana de S. cerevisiae e a repressão catabólica, levando a inibição por glicose (C6). Proteínas de membrana capazes de transportar xilose são inibidas em altas concentrações desse açúcar, além de apresentarem baixa afinidade a xilose em relação a glicose, levando a uma competição entre os substratos e estendendo o tempo da fermentação. A xilose somente é assimilada pelas células de S. cerevisiae quando as concentrações de glicose estão baixas no ambiente extracelular. Dessa forma, este projeto teve como objetivo a caracterização de novos transportadores heterólogos de xilose eficientes e o desenvolvimento de uma linhagem capaz de co-fermentar xilose e glicose. Neste trabalho, identificamos e caracterizamos quatro novos transportadores de xilose Cs186, Cs2608, Cs3894 e Cs4130, avaliados na linhagem EBY.VW4000 modificada com a via de consumo de xilose integrada no genoma. Curiosamente, o transportador Cs4130 demonstrou superior capacidade de assimilação de xilose em altas concentrações (50 g/L) em comparação com o controle GXF1, considerado o melhor transportador heterólogo previamente descrito na literatura. Na condição descrita, GXF1 foi severamente inibido, demonstrando um comportamento oposto ao observado por Cs4130. O modelo estrutural de Cs4130 em comparação com o transportador procariótico de alta afinidade XylE e GXF1 aponta resíduos em sua arquitetura molecular que possam explicar as diferenças de comportamento observadas entre os transportadores. Dessa forma, o novo transportador Cs4130 é apresentado como um excelente candidato para engenharia genética de linhagens de S. cerevisiae para a produção de biocompostos 2G. Entretanto, os transportadores de xilose Cs4130 e GXF1 ainda apresentam uma forte inibição pela glicose na mistura dos dois açúcares. Dessa maneira, a segunda parte do projeto visa a modificação dessas proteínas de membrana e o desenvolvimento de um processo para o aumento da afinidade a xilose em relação à glicose. Para isso, desenvolvemos duas novas plataformas de evolução adaptativa, EBY_Xyl1_hxk0 derivada da linhagem EBY_Xyl1, e a linhagem JBY_hxk0 construída a partir de uma cepa industrial fermentadora de xilose. Estas novas plataformas não são capazes de metabolizar moléculas de glicose devido as deleções dos genes das hexoquinases HXK1, HXK2 e GLK1, responsáveis pela primeira etapa da via da glicolítica. As células modificadas de S. cerevisiae irão reconhecer as moléculas de glicose apenas como inibidores ao metabolismo da xilose. Por fim, a identificação de novas mutações presentes nas células evoluídas derivadas das plataformas construídas, capazes de co-fermentar xilose e glicose, visam identificar novos alvos moleculares relacionados a repressão catabólica. As informações desenvolvidas nesse projeto irão auxiliar no desenvolvimento de linhagens de S. cerevisiae capazes de fermentar simultaneamente xilose e glicose, reduzindo o tempo final de fermentação na indústria 2G.

Abstract: The global energy matrix is based on fossil fuels, such as oil, gas and coal. In recent decades, the world community has expressed an intense concern related to the consequences caused by the use of these compounds, such as the increase in greenhouse gas emissions. Second-generation (2G) ethanol, produced from lignocellulosic biomass, emerges as promise sustainable advanced biofuel. However, several biotechnological challenges need to be overcome in order to produce economically viable 2G ethanol. The development of engineered Saccharomyces cerevisiae yeast strains, capable of converting xylose, the second most abundant sugar on lignocellulosic biomass, into ethanol, is an essential step to a feasible 2G process. A major bottleneck in the conversion of bioproducts from these biomass-derived sugars is the low xylose uptake by S. cerevisiae membrane transporters and catabolic repression, leading to glucose inhibition (C6). Membrane proteins capable to transport xylose are strongly inhibited on high concentrations of this sugar, in addition to presenting low affinity to xylose compared to glucose, leading to competition between substrates and extending the fermentation time. Xylose is only assimilated by S. cerevisiae cells when glucose concentrations are low in the extracellular environment. Therefore, this project aimed to identify novel and efficient heterologous xylose transporters and to develop a strain capable of co-fermenting xylose and glucose. In this work, we identified and characterized four new xylose transporters Cs186, Cs2608, Cs3894 and Cs4130, evaluated in EBY.VW4000 strain modified with the xylose consumption pathway integrated into the genome. Curiously, the Cs4130 transporter demonstrated a superior capacity of xylose assimilation at high xylose concentrations (50 g/L) compared to the GXF1 control, considered the best heterologous transporter previously described in the literature. In the condition described, GXF1 was severely inhibited, demonstrating an opposite behavior compared to that observed by Cs4130. The structural model of Cs4130 compared to the high affinity prokaryotic transporter XylE and GXF1 points out residues in its molecular architecture that may explain the differences in behavior observed between the transporters. The novel transporter Cs4130 is presented as an excellent candidate for genetic engineering of S. cerevisiae strains for 2G biocompounds production. However, the xylose transporters Cs4130 and GXF1 show strong glucose inhibition on mixtures of both sugars. Therefore, the second part of the project aims to engineering these membrane proteins and to develop a process to increase the affinity of xylose compared to glucose. We have developed two new microbial platforms for adaptive evolution, EBY_Xyl1_hxk0, derived from EBY_Xyl1 strain, and the JBY_hxk0 constructed from an industrial high-yield pentose fermenting strain. These new platforms are unable to metabolize glucose molecules due to the disruption of glycolysis pathway by knockout of hexokinase genes, HXK1, HXK2 and GLK1. The S. cerevisiae modified strains recognized glucose molecules only as an inhibitor to xylose metabolism. Therefore, new genetic mutations present in these evolved cells, capable to co-consume xylose and glucose, will provide new data to understand the genetic basis of glucose repression. The information produced in this project will help the development of S. cerevisiae strains suitable of simultaneously fermenting xylose and glucose, reducing the total fermentation time in the 2G industry.
Subject: Saccharomyces cerevisiae
Repressão catabólica
Açúcar - Transporte
Sistema CRISPR/Cas9
Language: Multilíngua
Editor: [s.n.]
Citation: BUENO, João Gabriel Ribeiro. Genetic engineering of Saccharomyces cerevisiae for co-fermentation of xylose and glucose to second-generation ethanol production : Engenharia genética de Saccharomyces cerevisiae para cofermentação de xilose e glicose e produção de etanol de segunda geração . 2020. 1 recurso online ( 116 p.) Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia, Campinas, SP.
Date Issue: 2020
Appears in Collections:IB - Tese e Dissertação

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