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Type: DISSERTAÇÃO
Degree Level: Mestrado
Title: Estudo da expressão do Gene ABR em leucemia mieloide cronica (LMC) utilizando real-time RT-PCR (qPCR),
Title Alternative: Expression of active BCR related (ABR) gene in chronic myeloid leukemia (CML) real-time RT-PCR (qPCR)
Author: Namasu, Carolina Yaeko
Advisor: Alberto, Fernando Lopes
Abstract: Resumo: Leucemia mielóide crônica (LMC) é uma doença mieloproliferativa crônica resultante de alteração citogenética t(9;22) (q34; q11) que acarreta atividade constitutiva de tirosino-quinase por meio da proteína quimérica BCR-ABL. Esta alteração ocorre nas células precursoras hematopoéticas e pode ser detectada em todas as células descendentes. O mesilato de imatinibe (Glivec®) é um inibidor do receptor do fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF-R), proteína quinase do BCR-ABL, administrado com sucesso a pacientes portadores de LMC. Porém, algumas formas de resistência ao tratamento têm sido apontadas, e as mais conhecidas envolvem o surgimento de mutações no domínio com atividade de quinase da proteína BCR-ABL. Entretanto, parece claro que o surgimento mutações adquiridas que acarretem ganho de função não é capaz de explicar todos os casos de resistência e que outros sistemas gênicos podem estar envolvidos neste fenótipo adverso. O gene ABR possui grande homologia com o gene BCR e aparentemente apresenta funções características e outras compartilhadas com esse último. Neste trabalho, avaliamos a expressão do gene ABR em amostras de medula óssea e sangue periférico de pacientes portadores de LMC em fase crônica ao diagnóstico e em pacientes que receberam transplante alogênico de medula óssea, utilizando a técnica de RT-PCR quantitativo em tempo real (qPCR). ABR apresentou notável aumento de expressão relativa a indivíduos normais (mediana = 5,483) em 8 de 9 pacientes de LMC avaliados em fase crônica ao diagnóstico, de acordo com o teste Wilcoxon signed rank (p-valor = 0,01563), o que se correlaciona com resultados anteriores de nosso grupo (Alberto e Costa, 2003). Diminuição nos níveis de expressão do ABR parece correlacionar-se com o status de remissão dos pacientes analisados, conforme avaliado pela expressão do transcrito BCR-ABL por PCR quantitativo em tempo real, o que pode ser confirmado nos pacientes em remissão molecular ao transplante alogênico de medula óssea. Estes dados poderiam sugerir uma possível importância do gene ABR durante a evolução da doença. A expressão do gene ABR foi normalizada com os dois genes controle com melhor desempenho, ACTB e GAPD, utilizando-se o algoritmo geNorm. As eficiências de amplificação das reações de qPCR foram avaliadas e resultaram em valores semelhantes e próximos a 100%. Sensibilidade analítica da reação de qPCR resultou em uma detecção mínima de 1, 12, 10 e 9 moléculas, respectivamente, para ABR, BCR, ACTB e GAPD. O método mostrou-se útil para medida precisa dos níveis de expressão gênica, e adequada para estudar a relevância de sinais biológicos de pequena intensidade

Abstract: Chronic myeloid leukemia (CML) is a clonal proliferative disorder of the hematopoietic stem cell cytogenetically characterized by the Philadelphia (Ph) chromosome, a result of chromosomal translocation t(9;22)(q34;q11). At molecular level, the Ph chromosome results in a fusion gene, the chimerical BCR-ABL which has constitutive tyrosine kinase activity and is detected in virtually all cases at diagnosis. Indeed, the BCR-ABL gene expression has a pivotal role in the known pathogenetic mechanisms in CML cell proliferation and disease progression. Conversely, BCR-ABL inhibition with imatinib mesilate (Glivec®) efficiently produces disease remission, since it is capable of selectively block the protein through occupying its ATP binding site. However, resistance to imatinib mesilate do occur and, although acquired mutations in the tyrosine kinase domain of BCR-ABL have been described, it seems that the appearance of acquired mutations, which result in gain of function, does not suffice for the resistant phenotype. Active BCR Related (ABR) gene is similar to BCR and both have a GTPase-activating protein (GAP) domain. Increased ABR activity has been detected in different solid tumors and more recently we detected over-expression of ABR in CML cDNA (EST) library. The aim of this study was to investigate the expression levels of the ABR gene in peripheral blood and bone marrow samples of CML patients in chronic phase (CP) at diagnosis and in patients who had received bone marrow transplantation (BMT) and achieved remission by using real-time quantitative RT-PCR (qPCR). ABR gene was expressed in higher levels in 8 of 9 samples derived from CP patients evaluated at diagnosis (median fold change = 5.483) when compared to a pool of healthy subjects, according to Wilcoxon signed rank test (p-value = 0.01563), what correlates with our previous results (Alberto & Costa, 2003). These data could suggest a possible regulatory function of ABR gene on disease evolution. In all cases, qPCR efficiency ranged above 98%. ABR gene expression was normalized with the best performing control genes, ACTB and GAPD (geometric mean; geNorm algorithm). Reduction of ABR gene expression was apparently correlated with the remission status of the patients evaluated an observation that was further confirmed in patients in molecular remission after allogeneic bone marrow transplantation. Analytical sensitivity in GeneAmp 5700 Sequence Detector System was tested by amplification with ABR, BCR, ACTB e GAPD primers and resulted in minimal detection of de 1, 12, 10 e 9 molecules, respectively. The normalization strategy adopted in this work was helpful for accurate qPCR profiling, and is especially suitable for studying the relevance of biological signals of low intensities
Subject: Leucemia mielóide crônica
Expressão gênica
Biologia molecular
Language: Português
Editor: [s.n.]
Citation: NAMASU, Carolina Yaeko. Estudo da expressão do Gene ABR em leucemia mieloide cronica (LMC) utilizando real-time RT-PCR (qPCR),. 2006. 83 p. Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas, Campinas, SP.
Date Issue: 2006
Appears in Collections:FCM - Tese e Dissertação

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