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Type: DISSERTAÇÃO DIGITAL
Degree Level: Mestrado
Title: Manipulação genética de fatores de transcrição diferencialmente expressos sob indução de expressão de enzimas heterólogas em Aspergillus nidulans : Genetic manipulation of differentially expressed transcription factors under induction of expression of heterologous enzymes in Aspergillus nidulans
Title Alternative: Genetic manipulation of differentially expressed transcription factors under induction of expression of heterologous enzymes in Aspergillus nidulans
Author: Antoniel, Everton Paschoal, 1995-
Advisor: Damásio, André Ricardo de Lima, 1983-
Abstract: Resumo: Como forma de reduzir a dependência em combustíveis fósseis, os biocombustíveis e produtos químicos obtidos através da hidrólise enzimática da biomassa vegetal vem sendo foco de inúmeras investigações científicas. Todavia, a recalcitrância natural da parede celular vegetal, e o alto preço das enzimas ativas em carboidratos, fazem com que a sua degradação completa e eficiente ainda seja um desafio a ser superado para sua viabilização econômica. Dessa forma, o objetivo central deste trabalho foi avaliar a influência da manipulação genética de fatores de transcrição (FTs) sobre os níveis de produção/secreção de enzimas degradadoras da biomassa vegetal. Sabe-se que existe uma relação direta entre superexpressão de genes e estresse de retículo endoplasmático em fungos filamentosos. Em respostas a isso, a célula desencadeia um intenso programa, chamado unfolded protein response, para manter a proteostase celular. Desta forma os FTs manipulados neste trabalho foram selecionados a partir de dados de RNAseq, enriquecimento de GO terms e redes de co-expressão gênica do fungo modelo Aspergillus nidulans exposto ao estresse celular induzido pela superexpressão e secreção de proteínas heterólogas. Estas análises resultaram na seleção de 5 FTs - AN8772, AN9373, AN7331, AN7913, e AN7592 - presentes em módulos de co-expressão enriquecidos com GO terms tais como: proteasomal ubiquitin-independent protein catabolic process (GO:0010499), sporulation (GO:0043934), calcium ion homeostasis (GO:0055074), Golgi vesicle transport (GO:0048193), translation (GO:0006412), protein refolding (GO:0042026) e small molecule catabolic process (GO:0044282). Os 5 FTs foram deletados com sucesso em A. nidulans através da técnica de CRISPR-Cas9. O fenótipo das cepas mutantes foi avaliado quanto a integridade de parede celular (Congo Red ¿ CR e Calcofluor White ¿ CFW), estresse osmótico (Sorbitol), estresse iônico (CaCl2), estresse oxidativo (Menadiona), esporulação e secreção de proteases. A cepa delta AN7913 e delta AN7592 foram as mais resistentes a estressores da integridade de parede celular. A cepa ?AN7592 foi a única a apresentar esporulação reduzida e resistência a estresse osmótico. Para avaliação da resposta de estresse oxidativo a cepa delta AN8772 foi mais sensível, enquanto o delta AN7913 foi mais resistente. Nas análises de proteases as cepas delta AN9373, delta AN7331 e delta AN7913 tiveram um aumento na secreção de proteases, demostrando que estes FTs podem ter potencial função na regulação da via de secreção. Além disto, o processo da construção das cepas super-expressando uma enzima heteróloga está em andamento e poderá responder se estes FTs têm influência na secreção de enzimas heterólogas em A. nidulans. Concluímos que foi possível selecionar FTs potencialmente envolvidos na via de secreção de proteínas em A. nidulans utilizando dados de transcriptoma e redes de co-expressão. Além disso, demonstramos que o FTs deletados estão envolvidos em diferentes processos biológicos, destacando o dado preliminar em que demonstramos maior secreção de proteases em alguns mutantes. Por fim, pretendemos aprofundar nossos estudos realizando experimentos adicionais para avaliar os níveis de secreção destes mutantes através da superexpressão de uma enzima recombinante alvo e, eventualmente, descrever o mecanismo que induz este possível aumento de secreção

Abstract: As a way to lessen dependence on fossil fuels, biofuels and chemical products obtained through enzymatic hydrolysis of plant biomass, has been the focus of several scientific investigations. However, the recalcitrance of the plant cell wall, and the high price of hydrolytic enzymes mean that its complete and efficient degradation is still a challenge to be overcome for its economic viability. Therefore, the main goal of this project is to evaluate the influence of genetic manipulation of transcription factors (TFs) on the levels of production/secretion of degrading enzymes from plant biomass. It is known that there is a direct correlation between overexpression of genes and endoplasmic reticulum stress in filamentous fungi. In response to this, a cell triggers an intense program, called unfolded protein response, to maintain cellular proteostasis. Thus, the TFs manipulated in this work were selected from RNAseq data, enrichment of GO terms and genetic co-expression network of the fungus model Aspergillus nidulans exposed to cell stress induced by overexpression and secretion of heterologous proteins. This analysis resulted in the selection of 5 TFs - AN8772, AN9373, AN7331, AN7913 and AN7592 - which were in co-expression modules enriched with GO terms such as: proteasomal ubiquitin-independent protein catabolic process (GO: 0010499), sporulation (GO: 0043934), calcium ion homeostasis (GO: 0055074), Golgi vesicle transport (GO: 0048193), translation (GO: 0006412), protein refolding (GO: 0042026) and small molecule catabolic process (GO: 0044282). The 5 TFs were successfully deleted in A. nidulans using the CRISPR-Cas9 technique. The phenotype of the mutant strains was evaluated for cell wall integrity (Congo Red - CR and Calcofluor White - CFW), osmotic stress (Sorbitol), ionic stress (CaCl2), oxidative stress (Menadione), sporulation and protease secretion. The strain delta AN7913 and delta AN7592 were the most resistant to stressors of cell wall integrity. The strain delta AN7592 was the only one to present reduced sporulation and resistance to osmotic stress. To evaluate the oxidative stress response, the strain delta AN8772 was more sensitive, while delta AN7913 was more resistant. In the protease analysis, the strains delta AN9373, delta AN7331 and delta AN7913 had an increase in the secretion of proteases, demonstrating that these TFs may have a potential function in the regulation of the secretion pathway. In addition, the process of constructing strains overexpressing a heterologous enzyme is underway and will be able to answer whether these TFs have an influence on the secretion of heterologous enzymes in A. nidulans. It was concluded that it was possible to select TFs potentially involved in the protein secretion pathway in A. nidulans using transcriptome data and coexpression networks. In addition, we demonstrated that the deleted TFs are involved in different biological processes, highlighting our preliminary data that demonstrate greater secretion of proteases in some mutants. Finally, we intend to deepen our studies by carrying out additional experiments to assess the secretion levels of these mutants through the overexpression of a target recombinant enzyme and, eventually, to describe the mechanism that induces this possible increase in secretion
Subject: Aspergillus nidulans
Biologia de sistemas
Fatores de transcrição
Secreção
Language: Português
Editor: [s.n.]
Citation: ANTONIEL, Everton Paschoal. Manipulação genética de fatores de transcrição diferencialmente expressos sob indução de expressão de enzimas heterólogas em Aspergillus nidulans: Genetic manipulation of differentially expressed transcription factors under induction of expression of heterologous enzymes in Aspergillus nidulans. 2020. 1 recurso online ( 63 p.) Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia, Campinas, SP.
Date Issue: 2020
Appears in Collections:IB - Tese e Dissertação

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