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Type: TESE DIGITAL
Degree Level: Doutorado
Title: Investigação de novos mecanismos fisiopatológicos da hipercoagulabilidade na doença falciforme : Investigation of new pathophysiological mechanisms of hypercoagulability in sickle cell disease
Title Alternative: Investigation of new pathophysiological mechanisms of hypercoagulability in sickle cell disease
Author: Hounkpe, Bidossessi Wilfried, 1985-
Advisor: De Paula, Erich Vinicius, 1972-
Abstract: Resumo: Introdução: A anemia falciforme (AF) é uma hemoglobinopatia caracterizada por inflamação crônica e importante risco de eventos tromboembólicos venosos. Apesar dos avanços na caracterização das consequências da hipercoagulabilidade nestes pacientes, pouco se sabe sobre os mediadores críticos para ativação e perpetuação da coagulação nestes pacientes. No entanto, estudos realizados nos últimos anos sugeriram que o heme e a geração de redes extracelulares de neutrófilos (NETs) são dois elementos críticos da fisiopatologia da hipercoagulabilidade nesta doença. Embora já tenha sido demonstrado que o heme livre possa ter efeitos clinicamente relevante principalmente sobre a vasooclusão e síndrome toracica aguda via TLR4, seu efeito líquido sobre a coagulação é ainda assunto de muitas controversas. Além disso, evidências mostraram que a protéina PADI4 é um regulador crítico da formação de NETs e indicaram que sua inibição pode ser uma estratégia terapêutica no tratamento das doenças cuja fisiopatologia envolve a liberação de NETs como a AF. Embora atrativo, esta possibilidade exige um conhecimento mais detalhado do papel de PADI4 na AF. Objetivos: Na primeira parte deste estudo, nosso objetivo foi avaliar o efeito do heme sobre a ativação da coagulação no sangue total e explorar sua contribução na expressão, atividade e mecanismo de desencriptação do fator tecidual (FT) em células mononucleares. O segundo objetivo foi avaliar a expressão de genes envolvidos na formação de NETs (PADI4, MPO e Elane) em pacientes com AF e explorar suas correlações com marcadores de hipercoagulabilidade e com a gravidade da doença. Métodos: Na parte relativa aos efeitos do heme, a tromboelastometria foi usada para avaliar o efeito do heme sobre a ativação da hemostasia. Além disso a expressão do FT foi analisada por qPCR e sua atividade avaliada por um teste funcional de ativação do FX. A atividade de PDI foi avaliada usando um kit comercial. Por fim a contribuçao da via de TLR4 e o mecanismo de desencriptação mediado por PDI foram explorados usando inibidores específicos (Tak-242 e rutina para TLR4 e PDI respectivamente). Em relação à formação de NETs, duas coortes foram incluidas neste estudo. Na primeira coorte foi investigada a expressão gênica de PADI4, MPO e Elane por qPCR. Já na segunda coorte, a atividade de PADI4 foi analisada. Resultados: O heme foi capaz de induzir a ativação da hemostasia em amostras de sangue total. Este foi efeito foi amplificado pelo pré-tratamento com TNF-'alfa' e dependente da expressão e da ativação de FT, a qual foi posteriormente demonstrada em células mononucleares. A ativação do FT foi dependente da via TLR4 e ao menos parcialmente da via de desencriptação de FT mediada pela PDI. Já em pacientes com AF houve um aumento significativo da expressão dos genes PADI4, ELANE e MPO durante as crises vasoclusivas. A atividade de PADI4 aumentou no plasma de pacientes com AF durante as crises. Este resultados reforçaram o conceito de que heme e a regulação da formação de NETs pela PADI4 possam ser considerados como dois elementos relevantes da fisiopatologia da AF

Abstract: Introduction: Sickle Cell Anemia (SCA) is a hereditary hemoglobinopathy characterized by chronic systemic inflammation and a propensity for venous thromboembolic events. Despite advances in the characterization of hypercoagulability, which is a well-characterized consequence of this disease, the relative contribution of discrete mediators of coagulation activation for the loss of hemostatic balance observed in these patients is still not clear. In this regard, recent studies have been suggested that heme and the generation of neutrophil extracellular traps (NETs) should be viewed as critical candidate elements of the pathophysiology of hypercoagulability in this disease. Although it has been shown that free heme can trigger vasoocclusion and acute chest syndrome via TLR4, its net effect on the activation of coagulation is still controversial. Furthermore, recent evidences have shown that PADI4 is a critical regulator of NETs formation, so that its inhibition has been considered a potential therapeutic strategy in the treatment of diseases whose pathophysiology involves the formation of NETs such as SCA. Although attractive, this possibility requires a more detailed knowledge of PADI4 contribution to the pathophysiology of SCA. Objectives: In the first part of the study, we evaluated the effect of heme on the activation of coagulation in whole blood and investigated whether this effect was dependent of tissue factor (TF) expression and/or activation through TF decryption in mononuclear cells. In relation to study that involves NETs regulation, we intended to characterize the expression PADI4, MPO and Elane in patients with SCA and to explore their correlations with biomarkers of hypercoagulability and disease severity. Methods: Thromboelastometry was used to evaluate the effect of heme on hemostasis activation in whole blood. In addition, the expression of TF was analyzed by qPCR and its activity was evaluated by a functional FX activity assay. PDI activity was evaluated using a commercial kit. Finally, the contribution of the TLR4 pathway and the PDI-mediated decryption mechanism were explored using specific inhibitors (Tak-242 and rutin for TLR4 and PDI respectively). Regarding the formation of NETs, two cohorts were included in this study. In the first one, gene expression of PADI4, MPO and Elane was investigated by qPCR. In the second cohort, PADI4 plasmatic activity was analyzed. Results: Heme was able to induce hemostasis activation in whole blood samples. This effect was further amplified by pre-treatment with TNF-'alfa' and was dependent on TF expression and activation, as demonstrated in mononuclear cells. TF activation was dependent on TLR4 pathway and at least partially dependent on PDI-induced TF decryption. Significant increase of PADI4, ELANE and MPO gene expression was observed during vaso-occlusive crisis. PADI4 activity also increased in plasma of patients with SCA during vaso-occlusive crisis. Together, these results reinforced the concept that heme and NETosis regulation, through PADI4 activity, should be regarded as two relevant elements for the pathophysiology of SCA
Subject: Anemia falciforme
Heme
Peptidil arginina desiminase 4
Isomerases de dissulfetos de proteínas
Armadilhas extracelulares
Trombofilia
Language: Multilíngua
Editor: [s.n.]
Citation: HOUNKPE, Bidossessi Wilfried. Investigação de novos mecanismos fisiopatológicos da hipercoagulabilidade na doença falciforme: Investigation of new pathophysiological mechanisms of hypercoagulability in sickle cell disease. 2020. 1 recurso online (137 p.) Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas, Campinas, SP. Disponível em: http://www.repositorio.unicamp.br/handle/REPOSIP/348189. Acesso em: 27 Aug. 2020.
Date Issue: 2020
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