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Type: TESE DIGITAL
Degree Level: Doutorado
Title: Relevance of multi-species phenotypic assays in Leishmania early drug discovery : Relevância de ensaios fenotípicos com diversas espécies de Leishmania na descoberta inicial de fármacos
Title Alternative: Relevância de ensaios fenotípicos com diversas espécies de Leishmania na descoberta inicial de fármacos
Author: Ferreira, Thalita Camêlo da Silva, 1992-
Advisor: Freitas-Junior, Lucio Holanda
Abstract: Resumo: As leishmanioses são um grupo de doenças associadas à pobreza causadas por protozoários do gênero Leishmania. A complexidade desse kinetoplastídeo é evidenciada por aspectos biológicos, ecológicos e epidemiológicos. Essas doenças são endêmicas em mais de 98 países e acometem em torno de 12 milhões de pessoas. Aproximadamente 20 espécies de Leishmania infectam humanos e são transmitidas por 78 espécies de flebotomíneos. Uma vez infectados, os pacientes podem desenvolver diversas patologias dentre as quais as mais comuns são: leishmaniose cutânea, leishmaniose mucocutânea e leishmaniose visceral. Múltiplos determinantes estão envolvidos na manifestação clínica, incluindo complexas interações entre o parasita e o hospedeiro, além de fatores ambientais. As poucas farmacoterapias disponíveis são, em grande parte, insatisfatórias devido a baixa eficácia, pouca segurança, surgimento de resistência e outros aspectos relacionados ao tratamento (rota de administração, duração e custo elevado) que são incompatíveis com a realidade socioeconômica da população afetada. A atual conjuntura requer pesquisa focada na identificação de novas moléculas antileishmaniais. Devido aos avanços tecnológicos, atualmente é possível testar milhões de compostos de maneira contínua, entretanto, ainda é necessário o desenvolvimento de ensaios mais preditivos. É comum que grupos de pesquisa limitem os testes in vitro a uma única espécie, geralmente L. donovani, agente etiológico da doença visceral. Estabelecer ensaios com uma amostra representativa de espécies vicerotrópicas e dermotrópicas pode ser uma abordagem útil na priorização de compostos baseando-se no espectro de atividade. Este estudo objetivou a identificação de agentes antileishmaniais usando uma metodologia baseada em imagens. Uma padronização cuidadosa foi realizada para alcançar robustez e reprodutibilidade, focando em dois aspectos-chave: (i) o modelo biológico, determinando as condições para cultura da célula hospedeira e do parasita, parâmetros de infecção e tempo de exposição aos compostos; (ii) método de análise das imagens. O ensaio fenotípico foi estabelecido e validado para avaliar a atividade de compostos contra algumas das espécies dermotrópicas (L. amazonensis e L. braziliensis) e vicerotrópicas (L. donovani e L. infantum) mais relevantes clinicamente. Esse protocolo é semi-automatizado, baseia-se na infecção de células THP-1 com promastigotas em fase estacionária e tem potencial para ser adaptado a qualquer espécie infectiva in vitro, representando a base para descoberta de moléculas com amplo espectro. Um perfil espécie-específico foi observado na triagem de bibliotecas e uma quantidade reduzida de compostos foi ativa para todas as espécies. O teste da biblioteca Pathogen Box contra quatro espécies, juntamente com a análise da literatura, resultou na identificação de 12 compostos pan-antileishmaniais. Embora esses compostos terem atividade reportada contra kinetoplastídeos, o amplo espectro de ação contra diversas espécies de Leishmania não havia sido explorado. Os resultados obtidos nesse estudo demonstram o potencial da inserção de um conjunto de espécies nas etapas iniciais do processo de descoberta de novos fármacos, facilitando a prospecção, validação e progressão de compostos mais promissores. O painel de espécies, juntamente com outros ensaios secundários, é sugerido como integrante de um pipeline de ensaios celulares para Leishmania spp. objetivando a priorização de compostos baseada em aspectos cruciais além dos filtros tradicionalmente aplicados de propriedades físico-químicas e de toxicidade.

Abstract: The leishmaniasis are a group of poverty-associated diseases caused by the protozoan Leishmania spp. The complexity of this kinetoplastid parasite is highlighted by biological, ecological, and epidemiological aspects. It is endemic in more than 98 countries affecting around 12 million people. Approximately 20 species can be transmitted to humans by 78 species of the phlebotomine sandfly vector. Infected people can develop one of the several pathologies from which the most common are: cutaneous lesions, the disfiguring mucocutaneous disorder, and the life-threatening visceral disease. The final outcome is multifactorial, depending on intricate host-parasite interactions and environmental factors. The few chemotherapeutic options available are mostly unsatisfactory due to low efficacy, poor safety, emergence of parasite resistance, and other factors related to treatment (such as administration route, length of treatment or high costs) that are not suitable for the socioeconomic reality of affected populations. The current scenario demands research focused on the identification of novel effective therapeutics. Modern technologies enable the screening of millions of compounds, but a more predictive in vitro assays is still lacking. It is a common practice for a research group to target a single species, usually L. dovovani, the causative agent of visceral disease. Addressing a representative sample of viscerotropic and dermotropic species/strains of Leishmania can be useful to prioritize compounds based on their spectrum of activity. This work focused on the discovery of starting points for the development of new antileishmanials using an image-based methodology. Careful standardization was carried out aiming to achieve robustness and reproducibility, based on: (i) the biological model, determining the best condition for parasite and host cell culture, infection and drug exposure, and (ii) the image analysis algorithm. The multi-species high content assay was successfully established and validated to assess compound activity against some of the most clinically relevant dermotropic (L. amazonensis and L. braziliensis) and viscerotropic agents (L. donovani and L. infantum). This semi-automated assay is based on THP-1 macrophages infected with stationary phase promastigotes and can be virtually adapted to any in vitro infective species, providing the basis for the discovery of broad-spectrum antileishmanial molecules. A species-specific profile was observed in the general activity of libraries screenings, and a reduced number of compounds were active for all species. The simultaneous screening of the Pathogen Box library against four Leishmania species along with literature data analysis resulted in the identification of 12 pan-antileishmanial compounds. Although these molecules have been reported as anti-kinetoplastid agents, their activity against different Leishmania species had not been explored yet. The results obtained from this study demonstrate the potential value of including a panel of species in early steps of the drug discovery process, which can facilitate the prospection, validation and progression of more promising compounds. The species panel, together with other reported secondary assays, is suggested as part of a cell-based assay pipeline for Leishmania spp. aiming to empower the prioritization of compounds based on crucial aspects besides the physico-chemical and toxicity filters traditionally applied
Subject: Leishmania
Leishmaniose
Descoberta de drogas
Ensaios de triagem em larga escala
Language: Inglês
Editor: [s.n.]
Citation: FERREIRA, Thalita Camêlo da Silva. Relevance of multi-species phenotypic assays in Leishmania early drug discovery : Relevância de ensaios fenotípicos com diversas espécies de Leishmania na descoberta inicial de fármacos. 2019. 1 recurso online ( 121 p.) Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia, Campinas, SP.
Date Issue: 2019
Appears in Collections:IB - Tese e Dissertação

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