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Type: TESE DIGITAL
Degree Level: Doutorado
Title: Estudo da imobilização de dendrímeros na construção de um imunossensor baseado em SPR para detecção de troponina T em diagnósticos iniciais de infarto
Title Alternative: Study of dendrimer immobilization in the construction of a SPR-based immunosensor for detecting troponin T in early infarct diagnoses
Author: Giarola, Juliana de Fátima, 1992-
Advisor: Kubota, Lauro Tatsuo, 1964-
Abstract: Resumo: As doenças cardiovasculares são a principal causa de morte no mundo, sendo 85% delas devido à acidentes vasculares cerebrais e infartos agudos do miocárdio (IAM). O IAM atinge as as idades e o diagnóstico preciso e tratamentos médicos adequados são fundamentais para aumentar a taxa de sobrevivência. Este trabalho de doutorado envolveu o estudo da imobilização de diferentes gerações de dendrímeros PAMAM(G3, G4 e G5) na construção de um imunossensor baseado em ressonância de plásmons de superfície (SPR) visando o diagnóstico de quadros iniciais de IAM, utilizando o biomarcador troponina T. O melhor desempenho do imunossensor foi obtido utilizando os dendrímeros PAMAM( G4) 0,1 mmol L¡1 , combinados à monocamada auto-organizada (SAM) de ácido 3-mercaptopropiônico (MPA - 1,0 mmol L¡1 ). Os anticorpos de captura (20 ¹g mL¡1 ) foram imobilizados sobre os dendrímeros e os sítios não-específicos presentes no imunossensor foram bloqueados com BSA (30 ¹g mL¡1 ) e etanolamina (1,0mol L¡1 pH 8,5) por 5 minutos. O valor de KD estimado (8,3 x 10¡7 mol L¡1 ) sugere uma elevada afinidade entre o anticorpo de captura empregado e a biomarcador, favorecendo uma maior detectabilidade. Estudos de repetibilidade indicaram uma boa precisão do imunossensor desenvolvido com desvio padrão relativo menor que 10%. A regeneração dos sítios de ligação dos anticorpos de captura foi realizada utilizando tampão acetato de sódio 0,01 mol L¡1 pH 4,8 com 0,1% de Tween 20, permitindo a reutilização do imunossensor por mais uma vez. Os resultados mais promissores para o imunossensor proposto foram obtidos utilizando o ensaio "sanduíche", empregando dois tipos de anticorpos secundários: monoclonais, com faixa de resposta de 5,0 ¡ 300 ng mL¡1 e LOD de 3,6 ng mL¡1 e policlonais, com faixa de resposta de 3,0 ¡ 30 ng mL¡1 e LOD de 0,98 ng mL¡1 , ambos com um tempo de resposta de aproximadamente 30 minutos. Esses valores de LOD são muito próximos aos valores encontrados na corrente sanguínea de pacientes com quadros iniciais de IAM, podendo o imunossensor desenvolvido, ser empregado para este diagnóstico. A aplicação do imunossensor foi realizada em amostras de soro humano de pacientes saudáveis, por meio da recuperação de troponina T adicionada à matriz (88% a 104%), indicando resultados confiáveis nessa determinação. Outra aplicação foi realizada em amostras de pacientes com quadros iniciais de IAM, em que o valor obtido pelo imunossensor indicou resultados próximos ao método de imunoensaio por eletroquimioluminescência (ECLIA). Assim, os resultados obtidos neste trabalho de tese são substanciais para a contribuição no diagnóstico rápido de quadros iniciais de IAM, bem como no desenvolvimento de novas metodologias sensíveis à troponina T com custos reduzidos

Abstract: Cardiovascular diseases are the number one cause of death in the world, 85% of them due to strokes and acute myocardial infarctions (AMI). AMI affects people of all ages, and accurate diagnosis and appropriate medical treatments are critical to increasing the survival rate. This doctoral work involved the study of the immobilization of different generations of PAMAM dendrimers (G3, G4, and G5) in the construction of an immunosensor based on surface plasmon resonance (SPR) aiming at the diagnosis of early AMI using troponin T biomarker. The best performance of the immunosensor was obtained using the 0.1mmol L¡1 PAMAM(G4) dendrimers, combined with the self-assembled monolayer (SAM) of 3-mercaptopropionic acid (MPA - 1.0 mmol L¡1 ). The capture antibodies (20 ¹g mL¡1 ) were immobilized over dendrimers, and the non-specific sites in immunosensor were blocked with BSA (30 ¹g mL¡1 ) and ethanolamine (1.0 mol L¡1 pH 8.5) for 5 minutes. The value of KD estimated (8.3 x 10¡7 mol L¡1 ) suggests a high affinity between the capture antibody and the biomarker, favoring higher detectability. Repeatability studies indicated a good precision of the immunosensor developed with a relative standard deviation of less than 10%. The regeneration of the capture antibody binding sites was performed using 0.01 mol L¡1 pH 4.8 sodium acetate buffer with 0.1% Tween 20, allowing the reuse of the immunosensor for one more time. The most promising results for the proposed immunosensor were obtained using the "sandwich"assay, employing two types of secondary antibodies: monoclonal, with a response range of 5.0 ¡ 300 ng mL¡1 and LOD of 3.6 ng mL¡1 and polyclonal, with a response range of 3.0 ¡ 30 ng mL¡1 and LOD of 0.98 ng mL¡1 , both with a response time of approximately 30 minutes. These LOD values are very close to the values found in the bloodstream of patients with initial AMI, and the immunosensor can be used for this diagnosis. The immunosensor application was performed in human serum samples from healthy patients, by recovering troponin T added to the matrix (88% to 104%), indicating reliable results at this determination. Another application was carried out on a sample of patients with an initial AMI condition, in which the recovered value by the immunosensor agrees with the electrochemiluminescence immunoassay method (ECLIA). Thus, the results obtained in this thesis work are substantial for the contribution in the rapid diagnosis of early AMI, as well as in the development of new methodologies sensitive to troponin T with reduced costs
Subject: Biossensores
Troponina
Ressonância de plasmon de superfície
Dendrímeros
Language: Português
Editor: [s.n.]
Citation: GIAROLA, Juliana de Fátima. Estudo da imobilização de dendrímeros na construção de um imunossensor baseado em SPR para detecção de troponina T em diagnósticos iniciais de infarto. 2020. 1 recurso online (127 p.) Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química, Campinas, SP.
Date Issue: 2020
Appears in Collections:IQ - Tese e Dissertação

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