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Type: TESE DIGITAL
Degree Level: Doutorado
Title: Study of bacterial glycoside hydrolases for biotechnological applications : bioprospection, production and immobilization = Estudo de hidrolases glicosídicas bacterianas para aplicações biotecnológicas: bioprospecção, produção e imobilização
Title Alternative: Estudo de hidrolases glicosídicas bacterianas para aplicações biotecnológicas : bioprospecção, produção e imobilização
Author: Melo, Ricardo Rodrigues de, 1985-
Advisor: Sato, Helia Harumi, 1952-
Abstract: Resumo: A biomassa lignocelulósica é um importante recurso renovável que está prontamente disponível, sendo uma fonte de matéria-prima com alto potencial biotecnológico. Os polissacarídeos complexos que compõem lignocelulose podem ser convertidos em monossacarídeos fermentescíveis, com grande aplicabilidade em diversos bioprocessos industriais. A degradação dos materiais lignocelulósicos pode ser realizada por uma diversidade de vias enzimáticas complexas, onde é requerido um número considerável de enzimas ativas sobre carboidratos. Entre elas, as famílias das celulases e hemicelulases, além de atuarem na hidrólise dos materiais lignocelulósicos, possuem um uso versátil em setores industriais, tais como, nas áreas alimentícia, bebidas e de biocombustíveis. A tese teve como principais objetivos o delineamento de estratégias para a produção de enzimas e coquetéis enzimáticos eficientes para o uso na hidrólise da biomassa vegetal e, a aplicação de técnicas de imobilização para ampliar a utilização de enzimas em escala comercial. Inicialmente, a bioprospecção de novos micro-organismos secretores de enzimas atuantes na biomassa lignocelulósica foi realizada, e dentre as oitenta linhagens de Streptomyces testadas, duas linhagens (F1 e F7) se destacaram por apresentarem elevadas atividades celulolíticas e hemicelulolíticas. Uma abordagem genômica dessas linhagens possibilitou a identificação de 85 hidrolases glicosídicas (GHs) distribuídas em 33 famílias diferentes na linhagem F1, e 100 GHs dispostas em 44 famílias na linhagem F7. Além disso, os dados genômicos das linhagens F1 e F7 também indicaram a presença de genes relacionados à degradação da lignina. Ferramentas estatísticas também foram aplicadas e possibilitaram a ampliação da produção de GHs pela linhagem F1. Com a otimização, elevadas concentrações de GHs foram alcançadas com meio nutriente adicionado de 16,4 g L-1 de farelo de trigo e 10,0 g L-1 de caseína, onde se obteve 9,27 U mL -1 de xilanase e 0,22 U mL -1 de celulase. Para confirmar a diversidade de GHs expressas pela linhagem F1, uma análise por espectrometria de massa foi realizada e observou-se que quanto maior a complexidade da fonte de carbono utilizada, maior foi a gama de proteínas expressas, incluindo vários tipos de celulases e hemicelulases. A eficiência do extrato enzimático produzido pela linhagem F1 foi estudada para a sacarificação da biomassa vegetal e possibilitou um aumento significativo na liberação de açúcares quando adicionado ao extrato celulolítico comercial, indicando que as enzimas secretadas pela Streptomyces sp. F1 podem ser aplicadas para o melhoramento dos atuais coquetéis comerciais. Foi estudada também a criação de métodos de imobilização de enzimas em condições neutras de pH. Os novos suportes produzidos com a agarose foram utilizados para a imobilização de enzimas monoméricas e multiméricas de grande importância biotecnológica. Um estudo mais detalhado explorando os novos suportes e o uso de técnicas de pós-imobilização foi também proposto. O processo desenvolvido aplicando o polímero polietilenimina (PEI) possibilitou a formação de um excelente sistema para imobilizar e estabilizar a ?-glicosidase obtida de Exiguobacterium antarcticum. A ?-glicosidase imobilizada apresentou uma melhora em suas características, incluindo estabilidade térmica e de armazenamento. Além disso, a ?-glicosidase manteve sua atividade elevada mesmo após vários ciclos de hidrólise com celobiose como substrato

Abstract: Lignocellulosic biomass is an important renewable resource that is readily available, being a source of raw material with high biotechnological potential. The complex polysaccharides that compose lignocellulose can be converted into fermentable monosaccharides, with great applicability in several industrial bioprocesses. The degradation of lignocellulosic materials can be accomplished by a variety of complex enzymatic pathways, where a considerable number of carbohydrate active enzymes are required. Among them, the families of cellulases and hemicellulases, besides acting in the hydrolysis of lignocellulosic materials, have a versatile use in industrial sectors, such as in food, beverages and biofuels. The main aims of this thesis were the design of efficient strategies for the production of enzymes and enzymatic cocktails for use in plant biomass hydrolysis and the application of immobilization techniques to increase the use of enzymes in a commercial scale. Initially, bioprospection of new enzyme secreting microorganisms active in lignocellulosic biomass was performed, and among the eighty Streptomyces strains tested, two strains (F1 and F7) were distinguished by their high cellulolytic and hemicellulolytic activities. A genomic approach of these strains allowed the identification of 85 glycoside hydrolases (GHs) distributed in 33 different families the strain F1, and 100 GHs arranged in 44 families the strain F7. In addition, the genomic data from strains F1 and F7 also indicated the presence of genes related to lignin degradation. Statistical tools were also applied and allowed the increase in GH production by strain F1. With the optimization, high concentrations of GHs were achieved with a nutrient medium containing 16.4 g L-1 of wheat bran and 10.0 g L-1 of casein, where 9.27 U mL-1 of xylanase and 0.22 U mL-1 of cellulase were obtained. To confirm the diversity of GHs expressed by the strain F1, an analysis using mass spectrometry technique was performed and it was observed that the greater the complexity of the carbon source used, the greater the range of proteins secreted, including several types of cellulases and hemicellulases. The efficiency of the enzymatic extract produced with strain F1 was studied for the saccharification of plant biomass and allowed a significant increase in sugar release when added to the commercial cellulolytic extract, indicating that the enzymes expressed by Streptomyces sp. F1 can be applied for the improvement of the current commercial cocktails. The creation of enzyme immobilization methods under neutral conditions of pH was also study. The new agarose supports were used for the immobilization of monomeric and multimeric enzymes of great industrial and biotechnological importance. A more detailed study exploring the new supports and the use of post-immobilization techniques with polymers and small molecules was also proposed. The process developed by applying the polymer polyethyleneimine (PEI) enabled the formation of an excellent system to stabilize the glucose-tolerant tetrameric ?-glycosidase obtained from Exiguobacterium antarcticum. The immobilized ?-glycosidase showed an improvement in its characteristics, with an increased activity, including thermal and storage stability. In addition, the ?-glycosidase maintained a high activity even after several cycles of hydrolysis applying cellobiose as substrate
Subject: Glicosídeo hidrolases
Streptomyces
Genômica
Proteômica
Enzimas imobilizadas
Editor: [s.n.]
Citation: MELO, Ricardo Rodrigues de. Study of bacterial glycoside hydrolases for biotechnological applications : bioprospection, production and immobilization = Estudo de hidrolases glicosídicas bacterianas para aplicações biotecnológicas: bioprospecção, produção e imobilização . 2017. 1 recurso online (196 p.) Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos, Campinas, SP. Disponível em: http://www.repositorio.unicamp.br/handle/REPOSIP/340463. Acesso em: 8 May. 2020.
Date Issue: 2017
Appears in Collections:FEA - Tese e Dissertação

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